hiPSC-ACM和hiPSC-VCM进行药物毒性检测的效果研究

2021-10-20孙莹

世界最新医学信息文摘 2021年61期

孙莹

（广东司法警官职业学院司法鉴定中心，广东广州 510520）

0 引言

当前药物的毒性评价主要包括动物模型、动物原代心肌细胞等，通量较低，在实际应用中存在种属差异，影响毒性评价结果[1]。人源性诱导多能干细胞分化心房肌细胞（hiPSC-ACM）和心室肌细胞（hiPSC-VCM）与人体心肌细胞特征相同，避免了种属差异问题，能够无限增殖，缩短药物研发成本和时间，为药物毒性高通量筛查提供了重要的参考依据[2]。为了探讨体外评价心脏药物毒性的有效方法，本文就hiPSC-ACM和hiPSCVCM进行药物毒性检测的效果进行了探索。

1 资料与方法

1.1 一般资料。中科院上海细胞生物学研究所提供的hiPSC细胞系；美国Sigma公司提供的全反式视黄酸（RA）、RA通路抑制剂、鼠抗辅肌动蛋白（α-acti nin）；BIOBASE酶标仪；赛默飞Attune NxT流式细胞仪；BiO-Rad公司提供的无血清培养基、PBS溶液；翌圣生物科技（上海）有限公司提供的钙敏染料；美国Abcam公司提供的兔心室特异性标志物（MLC2v）抗体；BIO-RAD TC20自动细胞计数器。

1.2 方法。通过培养hiPCS细胞，用RA处理作为RA组，用RA抑制剂处理作为RAi组。待细胞分化到12～16 d时更换成纯化液，如可见成纤维细胞脱落则提可终止纯化过程，改为2%心肌培养基，隔日换液。使用细胞免疫荧光染色法、流式细胞法测定α-actinin、cTnT、MLC2v，使用Trizol法完成细胞RNA提取操作，逆转录为cDNA，使用实时荧光定量PCR测定MLC2v、MYH7、NR2F2、KCNA5表达。采用细胞活性实验、钙离子荧光探针检测细不同浓度特非那定、索他洛尔培养24 h后的hiPSCACM、VCM细胞活性和钙瞬变。

1.3 观察指标。比较两组细胞的心肌细胞纯度；比较两组心室肌细胞、心房肌细胞特异性标志物相对表达量；分析特非那定、索他洛尔在不同浓度下对hiPSC-ACM、VCM细胞活性和细胞钙瞬变的影响。

1.4 统计学分析。将数据录至SPSS 23.0，以χ2检验定性资料（%、n），以t检验定量资料（±s），P＜0.05，提示有差异。

2 结果

2.1 两组细胞的心肌细胞纯度比较。RA组cTnT阳性率为99.00%，RAi组为98.84%，两组细胞的心肌细胞纯度＞95%。两组细胞经免疫荧光双染MLC2v、α-actinin处理后，可见两组细胞均呈α-actinin表达，其中RA组M LC2v阳性率为6.42%，RAi组为94.56%，后者MLC2v表达阳性率高于前者。RA组分化的细胞90%以上为hiPSCACM，RAi组分化的细胞90%以上为hiPSC-VCM。

2.2 两组心室肌细胞、心房肌细胞特异性标志物相对表达量对比。RA组MLC2v、MYH7相对表达量低于RAi组，RA组NR2F2、KCNA5相对表达量高于RAi组，详见表1。

表1 两组心室肌细胞、心房肌细胞特异性标志物相对表达量对比（±s）

注：★P＜0.05。

2.3 特非那定在不同浓度下对hiPSC-ACM、VCM细胞活性和细胞钙瞬变的影响。药物浓度为100.00 μmol/L时，两种细胞活性明显降低。两种细胞的钙瞬变振幅在低浓度50 nmol/L时明显降低，见表2。

表2 特非那定在不同浓度下对hiPSC-ACM、VCM细胞活性和细胞钙瞬变的影响（±s）

注：培养24 h后进行比较；★P＜0.05。

2.4 索他洛尔在不同浓度下对hiPSC-ACM、VCM细胞活性和细胞钙瞬变的影响。浓度为1.00 μmol/L时两种细胞活性明显降低，低浓度1 μmol/L时ACM细胞钙瞬变振幅明显降低，VCM细胞的钙瞬变振幅随着药物浓度的增长并未发生明显变化，见表3。

表3 索他洛尔在不同浓度下对hiPSC-ACM、VCM细胞活性和细胞钙瞬变的影响（±s）

注：培养24 h后进行比较；★P＜0.05。

3 讨论

RA信号途径在心脏祖细胞发育、分化过程中具有重要的作用。相关报道显示，RA在早期发育期间能够促进肝细胞向心房肌样细胞方向分化，在体外诱导分化中得到了广泛应用[3]。本次研究结果显示，RA组cTnT阳性率为99.00%，RAi组cTnT阳性率为98.84%，说明两组心肌细胞纯度较高，其中RAi组MLC2v阳性率高于RA组，且RA组分化的细胞90%以上为hiPSC-ACM，RAi组分化的细胞90%以上为心室肌细胞（hiPSC-VCM），说明RA在心肌分化过程中可调控心肌亚群向心室或心房方向分化，作用有效率较高。且RA组MLC2v、MYH7相对表达量低于RAi组，RA组NR2F2、KCNA5相对表达量高于RAi组，提示RAi可促进hiPSCs向VCM分化，RA可促进hiPSCs向ACM分化[4]。

抗组胺药物特非那定、非选择性β受体抑制剂均为致心律失常药物，对人体心脏具有一定的毒性。本文中特非那定浓度为100 μmol/L时hiPSC-ACM、hiPSCVCM两种细胞活性明显降低，可见特非他定对心肌毒性较大，用药安全窗较窄，在低浓度50 nmol/L时两种细胞的钙瞬变振幅明显降低，且hiPSC-VCM细胞的钙瞬变振幅会随着药物浓度的增长而逐步下降。索他洛尔浓度为1.00 μmol/L时两种细胞活性显著下降，且随着浓度的升高细胞活性会随之降低，但细胞活性降幅较小，提示索他洛尔对心肌细胞的毒性较小，安全窗较宽，在低浓度1 μmol/L时hiPSC-ACM细胞的钙瞬变振幅明显降低，而hiPSC-VCM细胞的钙瞬变振幅随着药物浓度的增长并未发生明显变化，表明索他洛尔对心房肌细胞钙活动的影响更加明显[5-6]。

综上所述，hiPSC-ACM、hiPSC-VCM可能通过调控RA通道分化的心室、心房肌细胞建立体外毒性评价模型，通过检测两种细胞的钙瞬变、细胞活性可为医师评价药物毒性提供重要的参考依据。