谷胱甘肽过氧化物酶4介导的铁死亡在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用

张清峰，刘 奎，杨晓燕，唐 波，黄 云

自贡市第四人民医院 胸心外科 (自贡 643000)

全世界每年死于肺癌的人数超过100万。在肺癌患者中约80%的病例是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)[1-2]。手术是治疗早期NSCLC的主要方法，但大多数NSCLC患者在确诊时已属于晚期并伴有远处转移[2-3]，因此，化疗是其主要治疗手段。顺铂(cis-diaminodichloro platinum，DDP)是目前NSCLC在临床治疗中的首选药物，治疗效果较好[4]。但在化疗过程中，DDP易产生耐药性，导致治疗失败[5],因此需要深入研究DDP的耐药机制。

铁死亡是新近发现的一种新的细胞死亡模式，不饱和脂肪酸过氧化，使脂质过氧化ROS(Lipid ROS)积聚，最终引起细胞死亡[6-8]。已有研究[9-11]报道，肿瘤细胞的耐药性与谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)的表达和活性相关。GPX4可保护肿瘤细胞膜免受Lipid ROS的影响，从而对化疗药物产生耐药性，抑制GPX4的活性，可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[9]。而GPX4是铁死亡过程中重要的Lipid ROS调控分子，其对Lipid ROS的清除可抑制铁死亡发生[12-13]。研究[14-15]显示，GPX4在NSCLC中可促进肿瘤细胞的增殖与转移；在NSCLC细胞中抑制GPX4的表达，能明显增强其对化疗药物的敏感性。以上研究表明，GPX4调控的铁死亡发生可能与肿瘤细胞的化疗药物耐药性密切相关。因此，本文以GPX4介导的铁死亡为切入点，研究GPX4介导的铁死亡发生在A549/DDP耐药中的作用，为NSCLC的临床用药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人NSCLC细胞株(A549)、人NSCLC DDP耐药株(A549/DDP)购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养基、链霉素、青霉素、0.25%胰酶购自美国Hyclone公司；活性氧自由基(ROS)检测试剂盒、Lipo8000转染试剂、RIPA裂解液购买自上海Beyotime公司；胎牛血清购自德国PAN公司；CCK-8试剂盒、Lipid ROS检测试剂盒(Liperfluo)购自日本同仁化学公司；RSL3、Fer-1、DDP购自美国Selleck公司；鼠抗β-actin、GAPDH单克隆抗体购自武汉Abclonal公司；兔抗GPX4购自美国Bimake公司；兔二抗、鼠二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 细胞培养

A549与A549/DDP细胞放置在含10%胎牛血清与1%双抗的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2恒温孵箱中培养，待细胞密度在80%～90%时，用浓度为0.25%的胰酶消化传代。

1.3 细胞转染及分组

取对数生长期的A549细胞，胰酶消化后，按照每孔70%左右的比例铺于6孔板中，培养过夜后，按照Lipo8000说明书要求转染pcDNA3.1-GPX4及pcDNA3.1质粒至A549细胞，根据转染质粒不同分为阴性对照组(pcDNA3.1组)以及质粒过表达组(pcDNA3.1-GPX4组)进行后续的CCK8及蛋白质印迹技术检测。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的细胞加入96孔板中 (5×103个/孔、150 μL/孔)，于恒温孵箱中培养。待细胞贴壁后，换新鲜培养基，加入不同浓度的DDP(0、1、2、4、8、10 g/L)，置于恒温孵箱中继续培养48 h，然后按照CCK8试剂盒说明书检测细胞增殖，计算细胞对药物抑制率为50%时的药物浓度(50% inhibitory concentration，IC50)值。

1.5 蛋白质印迹技术

取对数生长期的A549、A549/DDP细胞，A549转染阴性对照质粒及GPX4过表达质粒后的细胞，用DDP(5 μg/mL)、RSL3(2 μg/mL)、DDP+RSL3处理48 h后的细胞，胰酶消化后，用PBS洗两次。加入适量RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min后，4 ℃，12 000 r/min，离心半径13.5 cm;离心15 min，收集上清，加入5×蛋白loading buffer制样。用浓度为12%的SDS-PAGE电泳后转0.22 μm的PVDF膜。将转好的PVDF膜用5%的脱脂奶粉于室温下封闭1 h，然后一抗4 ℃孵育过夜。第2天，用TBST洗涤一抗孵育过夜的PVDF膜3次，10 min/次。二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次。用显影液与曝光机曝光。

1.6 细胞总ROS含量测定

将pcDNA3.1及pcDNA3.1-GPX4质粒转染A549/DDP细胞48 h后，分别用DDP(5 μg/mL)、RSL3(2 μg/mL)、Fer-1(1 μmol/mL)、DDP(5 μg/mL)+Fer-1(1 μmol/L)、DDP(5 μg/mL)+RSL3(2 μg/mL)继续处理48 h。将处理后的细胞用0.25%的胰酶消化后，用1×PBS缓冲液洗涤细胞2次，按照试剂盒要求加入适量DCFH-DA染色液，37 ℃孵育30 min，每隔3～5 min颠倒混匀1次。孵育完成后用无血清1640培养基洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞的染色液，用流式细胞仪(488 nm/525 nm)检测，并进行数据分析。

1.7 Lipid ROS含量测定

将上述处理后的细胞用0.25%的胰酶消化后，用1×PBS缓冲液洗涤细胞2次，按照试剂盒要求加入适量Liperfluo染色液，37 ℃孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀1次。孵育完成后用无血清1640培养基洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞的染色液，用流式细胞仪(488 nm/525 nm)检测，并进行数据分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 GPX4在A549与A549/DDP细胞中的表达

蛋白质印迹技术结果显示，在A549/DDP中GPX4的表达高于A549细胞，差异有统计学意义(t=7.880，P= 0.001)(图1)。

图1 GPX4在A549与A549/DDP细胞中表达比较

2.2 GPX4在A549细胞中过表达对DDP耐受性的影响

在A549细胞中转染GPX4的过表达质粒pcDNA3.1-GPX4后，与对照组(转染pcDNA3.1空载)相比，GPX4的表达量明显增加(t=10.810，P=0.001)(图2)。CCK8结果显示，GPX4在A549细胞中过表达后，可明显增强A549细胞对DDP的耐受性(P<0.05)(表1)。

图2 GPX4在A549细胞中过表达对DDP耐受性的影响

表1 DDP在两组中的IC50值比较

2.3 RSL3对A549/DDP细胞DDP敏感性的影响

用铁死亡激动剂RSL3可以抑制A549/DDP细胞内GPX4的表达(t=4.930，P=0.008)；将RSL-3与DDP联用，与单独的DDP处理组以及RSL-3处理组相比，GPX4表达量下调更加明显(P<0.05)(图3)，并且增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性(图4)。

图3 DDP、RSL3对A549/DDP细胞中GPX4表达的影响

图4 RSL3对A549/DDP细胞DDP敏感性的影响(×10)

2.4 铁死亡对A549/DDP细胞DDP敏感性的影响

为进一步明确GPX4介导的铁死亡与A549/DDP耐药的关系，用铁死亡抑制剂Fer-1处理A549/DDP细胞的同时，再用DDP处理，48 h后试剂盒检测铁死亡Marker(细胞活力、ROS以及Lipid ROS)，结果显示，DDP、RSL3处理A549/DDP细胞后，细胞铁死亡发生；而将两者连用后，细胞铁死亡发生更加明显，细胞对DDP敏感性增强。但用Fer-1抑制铁死亡发生时，Fer-1对A549/DDP细胞铁死亡发生没有明显影响；将DDP与Fer-1联合处理A549/DDP细胞，与单独的DDP处理组相比，联合处理组可抑制铁死亡发生，同时A549/DDP细胞对DDP的敏感性降低(表2)。

表2 铁死亡对A549/DDP药物敏感性的影响

3 讨论

在全球范围内每年有超过100万人死于NSCLS[1-2]。以DDP为基础的化疗策略是NSCLS临床治疗中的首选方案，但是DDP在临床治疗中极易引起耐药，导致化疗失败，无法提高患者的生存率[4-5]。因此，寻找新的耐药靶点或者与耐药相关的信号通路来降低DDP在NSCLS化疗中的耐药性至关重要。

铁死亡作为近年发现的一种新的细胞程序性死亡方式，被认为与多种疾病的发生密切相关[16-17]，其中GPX4介导的Lipid ROS的紊乱是铁死亡发生的关键过程[6]。已有研究[18-19]表明，胱氨酸转运蛋白Xc-复合物中xCT亚基在多种耐药肿瘤细胞中高表达，而xCT亚基的高表达会导致胞内还原性谷胱甘肽(GSH)含量升高，铁死亡被抑制。GSH又是GPX4对Lipid ROS清除中的关键底物，其表达量的升高会影响GPX4的表达[20]。

GPX4在肿瘤细胞耐药中发挥重要作用。研究[14]发现，抑制GPX4活性可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；Eaton等[15]研究发现，共价结合GPX4可作为增强化疗药物敏感性的关键靶点。本研究发现，GPX4在A549与A549/DDP细胞中表达差异有统计学意义(P<0.05)，该结果说明GPX4可能与A549/DDP细胞耐药性有关。本研究在A549细胞中过表达GPX4，结果发现，GPX4过表达后的细胞对DDP耐受性增强。鉴于GPX4在细胞铁死亡发生的关键作用，本研究在抑制铁死亡发生的情况下，检测A549/DDP细胞对DDP的敏感性。该结果显示，抑制铁死亡发生可降低A549/DDP细胞对DDP的敏感性，而通过RSL3抑制GPX4的表达与活性，激活A549/DDP细胞铁死亡，可增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性。以上结果显示，GPX4可通过抑制铁死亡发生，增强A549/DDP细胞对DDP的耐受性。

综上所述，GPX4的表达量与NSCLS细胞对DDP的耐药性呈正相关，而GPX4作为铁死亡调控的关键分子，其活性或表达量的抑制，可激活铁死亡发生，逆转肿瘤细胞耐药性，这为NSCLS耐药的临床研究提供了新视野。本研究仅在体外层面证实GPX4的高表达与A549/DDP细胞对DDP的耐药性密切相关，其具体的分子机制仍需进一步阐明，同时其在体内发挥的作用仍需进一步研究。