海金沙提取物对阻塞性黄疸大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及肝纤维化的影响

李媛 李屹 张晔 刘永林

阻塞性黄疸(obstructive jaundice，OJ)是指胆汁排泄受阻，胆汁不能排入十二指肠而造成胆汁淤积，引起黄疸的常见肝胆外科病症，可使肝脏受损严重，引起纤维化[1,2]。器官纤维化的发生发展与内质网应激密切相关[3,4]，内质网应激时激活PKR样内质网激酶(PKR-like ER kinase，PERK)，促进真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor-2alpha，eIF2α)磷酸化[5]，激活下游因子转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，从而激活C/EBP同源蛋白(C/EB phomologous protein，CHOP)[6,7]。中药海金沙为海金沙科海金沙属多年生蕨类植物，可全草入药[8]。目前对其药理活性的研究主要在抗氧化、抗菌、抗病毒、利胆、排石等方面，但作为传统中药，海金沙的功能仍有待进一步开发研究。本实验通过建立阻塞性黄疸大鼠模型，初步探究海金沙提取对阻塞性黄疸大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及肝纤维化的影响，为临床治疗提供可靠的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠，SPF级，体重200 g左右，购自辽宁省实验动物资源中心，生产许可证号为SCXK(辽)2015-0001。

1.2 实验试剂 伊红苏木精试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、蛋白提取试剂盒购自上海Beyotime公司；PERK抗体、eIF2α抗体、CHOP抗体、酶联免疫试剂盒均购自英国Abcam公司。

1.3 主要仪器 全自动生化分析仪购自美国Rayto公司；光学显微镜购自日本尼康公司；蛋白电泳仪、半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪购自杭州Miulab公司。

1.4 方法

1.4.1 海金沙的提取:参照文献[9]，制备海金沙提取物。海金沙全草粉碎，称取100 g，置于500 ml圆底烧瓶，加入纯化水400 ml，回流提取4次，2 h/次，合并提取液并浓缩。浓缩后加入95%乙醇沉淀，使乙醇含量达到80%，静置抽滤，室温干燥滤液，得到总膏，提取率约为2%。

1.4.2 阻塞性黄疸大鼠模型的制备:取健康雄性SD大鼠最少50只，随机分成5组：即假手术组、模型组、海金沙低剂量组、海金沙中剂量组、海金沙高剂量组，每组10只。参照文献制备阻塞性黄疸大鼠[10]，方法如下：按照45 mg/kg剂量的2%戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉大鼠，打开腹腔，沿肝十二指肠韧带寻找胆总管。将大鼠胆总管在十二指肠上方双重结扎中间剪断，关闭腹腔，从而建立胆道阻塞动物模型。假手术组大鼠仅游离胆总管但并不结扎。所有大鼠术后需做抗菌消炎处理。实验过程中，所有因手术、麻醉意外等原因死亡的动物，均应剔除出组，并采用备用大鼠补充，保证每组动物存活只数≥10只。

1.4.3 动物给药:用蒸馏水将海金沙提取物分别配制为5、10、15 mg/ml溶液，海金沙低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)、高剂量组(150 mg/kg)按照10 ml/kg剂量给大鼠灌胃，假手术组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃，1次/d，连续4周。

1.4.4 血清肝功能指标检测:将大鼠深度麻醉，打开腹腔，从肝下门静脉采集血液，离心收集血清，全自动生化分析仪检测大鼠肝功能指标，丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)。

1.4.5 血清肝纤维化指标检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)对血清中的肝纤维化指标进行检测，其中包括层黏连蛋白(Laminin，LN)，透明质酸酶(Hyaluronidase，HA)，Ⅲ型前胶原(Type Ⅲ procollagen，PCⅢ)，Ⅳ型胶原(Type Ⅳ collagen，Ⅳ-Col)。

1.4.6 大鼠肝脏组织的病理学观察和肝纤维化程度:处死大鼠，取出大鼠部分肝脏组织固定，制备病理组织切片，HE染色，光学显微镜下观察病理形态。另一部分肝脏组织至液氮中保存备用。肝纤维化分级标准[11]：肝脏组织内无纤维化为0级；肝窦周围、汇管区纤维化或肝小叶中出现纤维瘢痕为1级；大部分肝小叶结构完整，但能够看到纤维间隔为2级；肝小叶结构紊乱，纤维间隔较多，但没有肝硬化为3级；肝实质受损，纤维弥漫性增生，产生假小叶，肝硬化前期为4级。

1.4.7 肝脏组织细胞凋亡率的检测:利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒对大鼠肝脏细胞凋亡情况进行检测。显微镜下观察细胞核呈棕黄色的凋亡细胞。每个试验组分别随机选取10张切片，每张切片选择10个具有代表性的高倍视野(×400)，计数阳性细胞数，细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4.8 Western blot检测肝脏组织中PERK、eIF2α、CHOP蛋白的相对表达量:从液氮中取出保存的肝脏组织，提取总蛋白检测PERK、eIF2α、CHOP蛋白的相对表达情况，其中，β-actin蛋白作为内参蛋白。

2 结果

2.1 大鼠形态观察 术后24 h，模型组和药物处理组大鼠尿液颜色明显加深。48 h后，大鼠尾巴和耳朵出现黄染，随着胆管阻塞时间越来越长，症状越来越明显，食欲下降，精神萎靡不振。随机抽取大鼠解剖可发现，胆管畸形扩张，肝脏肿大，血液生化指标显示胆红素水平超标，由此，可判断为造模成功。连续灌胃4周后发现，药物处理组大鼠黄染症状减退，与模型组有明显区别。

2.2 大鼠血清肝功能指标比较 与假手术组相比，模型组ALT、AST及TBIL含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，海金沙处理组ALT、AST及TBIL含量明显下降，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清中ALT、AST及TBIL比较

2.3 血清肝纤维化指标比较 模型组LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平明显高于假手术组(P<0.05)。与模型组相比，海金沙低、中、高剂量LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平依次降低且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col比较

2.4 5组大鼠肝脏组织病理形态及肝纤维分级情况 假手术组大鼠肝小叶结构正常，肝窦正常，肝细胞排列规则，细胞核清晰，呈放射状，无明显炎细胞和纤维组织增生。模型组大鼠肝小叶受到严重破坏，肝窦充血，肝细胞受到严重损伤，小叶间胆管及纤维组织增生，炎性细胞浸润，出现大面积坏死。海金沙高剂量组的肝小叶受损较轻微，肝细胞排列趋于正常，仅有少量炎性细胞浸润和胆管、纤维组织增生。与假手术组比较，模型组大鼠纤维化分级显著上升(P<0.05)；与模型组相比，海金沙低中高剂量组的分级评分显著下降且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1，表3。

表3 5组大鼠肝纤维化分级比较

2.5 海金沙对大鼠肝脏组织细胞凋亡的影响 与假手术组相比，模型组肝脏细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。海金沙处理后，肝脏细胞的凋亡率明显下降，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表4。

表4 5组大鼠肝脏组织细胞凋亡率检测结果

2.6 5组大鼠肝脏中PERK、eIF2α、CHOP蛋白表达变化 与假手术组相比，模型组PERK、eIF2α、CHOP蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，海金沙处理组的PERK、eIF2α、CHOP蛋白相对表达量明显下降且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表5，图2。

表5 5组大鼠肝脏组织PERK、eIF2α、CHOP蛋白表达

图2 5组大鼠肝脏组织WB检测结果；1 假手术组；2 模型组；3 海金沙低剂量组；4 海金沙中剂量组；5 海金沙高剂量组

3 讨论

阻塞性黄疸是胆汁酸排出受阻形成淤积，并对肝及其他器官产生的一系列损伤[12-14]，临床表现为血清中ALT、AST、TBIL明显超过正常值。本实验采取结扎胆总管方法建立阻塞性黄疸大鼠模型，结果显示大鼠肝小叶结构受损严重，肝细胞大量坏死，炎性细胞浸润，小叶间胆管及纤维组织增生，血清中肝功能指标ALT、AST、TBIL及肝纤维指标LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平明显升高，表明阻塞性黄疸可引发大鼠肝功能受损，肝脏纤维化，造成肝功能障碍，揭示模型建立成功。

海金沙，又称迷离网、鸡胶莽、洗碗藤、金砂蕨等。其根状茎横走，叶轴攀援缠绕状，孢子囊两行并生，呈穗状[15]。传统中药常以海金沙全草或干燥孢子入药，其味甘淡、性寒，有清热解毒、活血通络、利湿利胆消肿的功效[16]。海金沙的利胆作用常用做治疗胆囊炎，并与其他中药相辅活血化瘀[17]。在本实验中采用水提醇沉法，从海金沙中提取活性成分，研究海金沙提取对阻塞性黄疸大鼠的防治作用。本研究结果显示，经海金沙提取物处理后，阻塞性黄疸大鼠肝组织病理损伤及纤维化程度减轻，肝细胞凋亡数量减少，血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、PCⅢ 及 Ⅳ-Col水平降低，且呈剂量依赖性，表明海金沙可减轻阻塞性黄疸大鼠肝组织病理损伤，改善肝功能，并随剂量升高而作用增强。

肝纤维化的发生与肝细胞的凋亡密切相关，抑制肝细胞凋亡可有效防止肝纤维的进展[18]。严重或长时间的内质网应激将激活凋亡信号通路诱导细胞凋亡，其中包括PERK/eIF2α/CHOP通路[19]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠肝组织中PERK、eIF2α、CHOP蛋白表达升高，提示内质网应激的标志性蛋白PERK表达增强，以及eIF2α、CHOP表达明显增加，说明在阻塞性黄疸肝纤维化过程中发生了内质网应激，可能导致肝细胞凋亡。李木松等[18]研究发现，茵陈蒿汤可通过抑制PERK、eIF2α和ATF4的活化，减少肝细胞凋亡，进而抑制内质网应激在胆汁淤积性肝纤维化中的促进作用。本研究采用海金沙处理后，阻塞性黄疸大鼠肝组织PERK、eIF2α、CHOP蛋白表达降低，且随着药物剂量的增大而更加显著，表明海金沙可下调PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白表达，提示海金沙减轻肝组织病理损伤，延缓细胞凋亡，修复肝功能的作用与抑制PERK/eIF2α/CHOP通路有关。

综上所述，海金沙可能通过抑制PERK/eIF2α/CHOP通路，降低阻塞性黄疸大鼠肝组织中纤维化水平，减轻肝细胞凋亡，改善肝功能，为临床治疗阻塞性黄疸的治疗提供了新思路。