二甲双胍对IFN⁃γ诱导的人卵巢颗粒细胞损伤的保护作用

姚 雪，刘 烁，俞宛君，陶泽华，蒋雅斓，陈少聃，冉银宏，夏 圣

江苏大学医学院免疫学教研室，江苏 镇江 212013

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种好发于育龄期妇女的内分泌紊乱疾病［1］。近年来的研究结果提示，PCOS 的发生发展与慢性炎症也密切相关［2］。干扰素（interferon，IFN）⁃γ是一种炎性细胞因子，在卵泡发育过程中主要分布在颗粒细胞（granular cells，GC）和卵母细胞中。颗粒细胞的增殖、分化在卵泡生长发育过程中起着十分重要的作用，而颗粒细胞的大量凋亡会影响卵泡细胞的正常发育、成熟，进而导致疾病产生［3］。本课题组前期体外实验研究发现，IFN⁃γ作用48 h后可明显抑制人卵巢颗粒细胞KGN 的增殖并促进细胞凋亡，但具体机制尚未探明［4］。二甲双胍（Metformin，Met）是一种胰岛素增敏剂，临床上主要用于治疗2型糖尿病［5］。近年来的一些研究发现，除降低血糖外，Met还可通过降低促炎因子表达水平、激活腺苷酸活化蛋白激酶途径、抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白合成通路、抑制氧化应激等机制发挥抗炎作用［6］。但目前对于Met能否改善炎症因子导致的卵巢颗粒细胞的细胞功能损伤尚不清楚。本研究旨在探讨Met对IFN⁃γ诱导的KGN细胞功能损伤的潜在保护作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

实验细胞株人卵巢颗粒细胞KGN细胞（上海江林生物科技有限公司）；IFN⁃γ（上海达科为生物技术有限公司）；Met（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；CCK⁃8检测试剂盒（上海碧云天生物公司）；细胞周期试剂盒（上海前尘生物科技有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；TRIzol RNA 提取试剂、逆转录试剂和Real Time PCR 试剂（TaKaRa公司，日本）；DMEM（上海源培生物公司）；胎牛血清（Nobimpex 公司，德国）；青霉素、链霉素和胰酶（Sig⁃ma⁃Aldrich 公司，美国）。细胞培养箱（Thermo 公司，美国）；生物安全柜（青岛海尔生物医疗公司）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；超高速低温离心机（Beckman Coulter 公司，美国）；酶标仪（Rayto 公司，美国）；流式细胞仪CytoFLEX（Beckman Coulter公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人卵巢颗粒细胞KGN 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中，并加入终浓度为100 U/mL的青霉素和链霉素，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱培养，每48 h换1次新鲜培养液。

1.2.2 CCK⁃8法检测KGN细胞活力

实验分组：对照组、IFN⁃γ处理组、Met 低/中/高浓度梯度组、IFN⁃γ与Met 低/中/高浓度梯度共处理组。取处于对数生长期KGN 细胞，用胰酶常规消化，将KGN细胞按3×103个/孔，接种至96孔板，每组设置5个复孔，置于37 ℃培养箱过夜预培养。第2天对照组常规换液，各处理组则根据分组要求，分别加入含IFN⁃γ（250 ng/mL）和Met（1、10、100 μmol/L）的细胞培养液。将细胞置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱，分别培养24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL CCK⁃8 反应试剂，继续置于培养箱孵育1 h后，酶标仪于450 nm检测各孔吸光度。本实验中Met 的浓度梯度参考以往的文献［7-8］设置。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期KGN 细胞，胰酶常规消化后以6×104个/孔培养于6 孔板内，每组设置3 个复孔，预培养1～2 d；各处理组中分别加入相应浓度的细胞培养液，处理KGN 细胞48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，并用预冷的PBS 洗涤2 遍。用标记细胞凋亡的结合缓冲液调节KGN 细胞浓度为5×105个/mL。在100 μL细胞悬液中加入1 μL Annexin V⁃APC和2 μL 7⁃AAD；混匀，室温避光孵育15 min。用结合缓冲液洗去未结合抗体，再用200 μL预冷的PBS重悬细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.2.4 细胞周期检测

各处理组中分别加入相应浓度的细胞培养液处理KGN细胞72 h后，收集细胞并用预冷的PBS洗涤2 遍；加入2 mL 70%预冷乙醇固定细胞，轻轻混匀，4 ℃过夜；离心去除固定液，用预冷的PBS 洗涤细胞2～3 次，离心，弃上清；按照细胞周期试剂盒说明书，分别加入100 μL 试剂A（胰蛋白酶等），轻轻混匀，室温放置10 min；加入100 μL 试剂B（RNA酶、胰酶抑制剂等）轻轻混匀，室温放置10 min；加入150 μL 试剂C（碘化丙啶等）轻轻混匀，室温放置15 min。上机前用300 目尼龙筛网过滤细胞液，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 q⁃PCR检测细胞周期负性调节蛋白CDKN1A mRNA的表达

TRIzol法提取各处理组的KGN 细胞总RNA，按照日本TaKaRa公司的逆转录试剂说明书将RNA逆转录为cDNA，置-20 ℃保存。以β⁃actin 为内参基因，qRT⁃PCR 反应体系（20 μL）：2×TB Green Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，无菌蒸馏水7.2 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共进行30 个循环。RNA 引物由上海生工生物工程有限公司合成。β⁃actin：正义5′⁃TCTGGCACCA⁃CACCTTCTA⁃3′，反义5′⁃AGGCATACAGGGACAG⁃CAC⁃3′；CDKN1A：正义5′⁃CTCATCCCGTGTTC⁃TCCTTT⁃3′，反义5′⁃GTACCAC⁃CCAGCGGACAAGT⁃3′。通过公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量。所有实验重复3次。

1.3 统计学方法

实验结果数据使用Graphpad Prism 5 软件进行统计分析，实验结果来自至少3次重复实验，计量资料用均数±标准差（）表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用SNK法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Met可提高IFN⁃γ诱导损伤的KGN细胞活力

CCK⁃8结果（图1）显示，与对照组相比，各处理组细胞在培养24 h 及72 h 后，除IFN⁃γ处理组细胞活力受到抑制（P<0.05）外，其他组未见明显变化。而培养48 h后，IFN⁃γ处理组细胞活力受到明显抑制（P<0.01，图1）；低、中、高浓度的Met 单独处理对KGN 活力均无明显影响，但Met与IFN⁃γ共同作用可减缓IFN⁃γ对KGN 细胞活力的抑制。其中，以中浓度Met 处理组（10 μmol/L）的缓解效应最为明显（P<0.01，图1），故后续试验均采用此药物浓度和处理时间。

图1 CCK⁃8检测不同处理对KGN细胞活力的影响Figure 1 The effects of different treatments on KGN cells viability detected by CCK⁃8

2.2 Met可改善IFN⁃γ对KGN细胞生长状态的影响

显微镜下观察各处理细胞的生长状态（图2），可见IFN⁃γ作用48 h后可使细胞增殖的速度和密度明显降低，且部分细胞皱缩、变圆。Met单独处理对KGN细胞的增殖效应无明显影响；但Met与IFN⁃γ共同作用则在一定程度上改善了被IFN⁃γ抑制的细胞增殖。

图2 不同处理对KGN细胞生长状态的影响（×40）Figure 2 The effects of different treatments on the growth of KGN cells（×40）

2.3 Met可减轻IFN⁃γ对KGN细胞凋亡的损伤

各处理组对KGN细胞处理48 h后，流式分析结果显示，对照组与Met 处理组的细胞凋亡比例统计分析无显著差异（P>0.05）。而IFN⁃γ处理后，细胞凋亡比例与对照组相比差异明显（P<0.01）。同时，Met+IFN⁃γ处理组细胞凋亡比例与单独IFN⁃γ处理组相比明显降低（P<0.05，图3）。以上结果表明，Met可减轻IFN⁃γ对KGN 细胞凋亡的损伤。

图3 流式检测不同处理对KGN细胞凋亡的影响Figure 3 The effects of different treatments on KGN cells apoptosis detected by flow cytometry

2.4 Met可缓解IFN⁃γ对KGN的细胞周期阻滞

流式分析时，先对KGN 细胞设门，去除细胞碎片；再对细胞周期分析的单细胞群体设门，去除黏连细胞，继而分析单细胞中处于各细胞周期的细胞比例。结果显示（图4），与对照组G0⁃G1期（54.432±2.526）、S 期（31.732±1.965）、G2⁃M 期（13.637±1.816）相比，Met处理组的各周期细胞比例均无明显变化；而与对照组相比，IFN⁃γ处理组G0⁃G1 期细胞比例（76.673±2.432）明显增加（P<0.01），S 期比例（12.137±1.586）下降（P<0.05），G2⁃M 期比例（11.276±1.398）也稍有下降但无统计学意义（P>0.05）；而与IFN⁃γ处理组相比，Met+IFN⁃γ处理组G0⁃G1 期细胞比例（71.152±1.861）下降，且S 期比例（19.572±1.615）升高，二者结果间的差异均具有统计学意义（P<0.05）。以上结果提示Met可缓解IFN⁃γ对KGN细胞由G0⁃G1期进入的S期阻滞效应。

图4 不同处理对KGN细胞周期分布的影响Figure 4 Effects of different treatments on the cell cycle distribution of KGN

2.5 Met对细胞周期的调控与CDKN1A下调有关

利用q⁃PCR法检测各处理组CDKN1A mRNA的表达，结果显示，IFN⁃γ处理可使KGN细胞的CDKN1A的mRNA 表达上调约5 倍，说明IFN⁃γ诱导的KGN G0⁃G1 期阻滞可能与CDKN1A 异常上调有关。当用Met 处理后，Met 可在一定程度上降低IFN⁃γ对CDKN1A 的诱导表达（P<0.05，图5）。此结果提示，Met 可能是通过下调IFN⁃γ诱导的CDKN1A 异常表达，从而减轻了IFN⁃γ引起的KGN 细胞G0⁃G1 周期阻滞。

图5 细胞周期复性调节蛋白CDKN1A mRNA的表达Figure 5 The mRNA expression of cell cycle refolding reg⁃ulatory protein CDKN1A

3 讨论

PCOS 是一种与异常卵泡增生相关的内分泌紊乱疾病，GC的增殖受抑被认为是异常卵泡成熟的关键因素［9］。既往研究表明，IFN⁃γ是卵泡闭锁的重要生理性调节因子，在卵泡发育早期未分化颗粒细胞Fas受体表达以及随后的凋亡反应中发挥了关键作用［3］。此外，基于其细胞抑制、抗增殖和促凋亡效应，IFN⁃γ被认为可应用于多种类型癌症的辅助免疫治疗［10-11］。前期研究结果发现，PCOS患者外周血中IFN⁃γ的含量较健康人明显增多，且IFN⁃γ体外作用于人卵巢颗粒细胞KGN 可明显抑制其增殖并促进凋亡；表明炎症因子IFN⁃γ可能是PCOS中导致KGN细胞功能损伤的重要因素之一［4］。

Met是一种常规降糖药，可作为胰岛素增敏剂，降低高胰岛素血症并抑制女性卵巢中过多雄激素的产生［12］。此外，在PCOS 大鼠模型中，Met 已被证明可抑制卵泡膜细胞增殖、减少小卵泡和囊肿的数量，进而提高排卵率［13］。最近有研究发现Met 可通过有机阳离子转运蛋白OCTs 诱导大鼠卵巢细胞AMPK 磷酸化并减少血管内皮生长因子VEGF 的产生［8］。本实验的研究结果显示Met单独作用对KGN细胞增殖、凋亡等功能无明显影响，原因可能是本实验使用的Met 的浓度较低，也可能是实验细胞株与其他研究来源不同。但本研究发现Met 与IFN⁃γ共同作用可提高损伤的KGN的细胞活力，缓解IFN⁃γ引起的细胞凋亡及G0⁃G1 周期阻滞，提示Met 可减轻IFN⁃γ诱导的KGN 细胞功能损伤。但Met 能否改善人卵巢颗粒细胞KGN的其他生物学行为，如细胞代谢，激素分泌及凋亡相关信号转导通路等还需进一步探究。

细胞功能紊乱常与细胞周期失调相关。文献报道，Met可通过不同作用方式调节细胞周期来抑制肿瘤细胞的增殖［14-15］。其中，Met可通过下调细胞周期调节蛋白cyclin D1的表达和端粒酶活性阻断G0/G1细胞周期，抑制人结肠癌SW480细胞生长［16］。因此猜测，Met 可能是通过调控细胞周期相关基因的表达，进而影响细胞功能。P21 基因是近年来发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员，可通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶复合物（cyclin⁃dependent kinases，CDKs）活性，协调细胞周期、DNA 复制与修复之间的关系。其中，CDKN1A是细胞周期负性调节因子p21 的编码基因，p21 的过度表达常提示细胞周期阻滞［17］。CDKN1A除了在细胞周期调控中发挥作用外，还参与了细胞分化、凋亡、自噬和衰老等过程［18］。本研究结果显示，IFN⁃γ处理将KGN的CDKN1A表达上调了约5 倍。Met与IFN⁃γ的联合处理可降低CDKN1A 的异常表达且差异具有统计学意义，提示CDKN1A 下调可能与Met一定程度上缓解了IFN⁃γ引起的KGN 细胞G0⁃G1周期阻滞相关，但其缓解周期阻滞的具体机制仍需进一步探索。

综上所述，本研究证实Met 可通过抑制细胞周期负性调节蛋白CDKN1A 表达的异常上调，缓解IFN⁃γ引起的KGN 细胞周期阻滞及细胞凋亡，从而发挥保护作用，可为指导PCOS 患者的临床用药提供新的视角。