5种浆果果酒抗氧化活性差异及综合评价

许立伟，王炳宇，杨馨悦，薛桂新*

（延边大学 农学院，吉林 延吉 133002）

蓝莓（Blueberry）不仅含有脂肪、蛋白质、维生素和大量的微量元素[1-2]，还富含花青素[3]、糖苷、黄醇酮等活性成分[4]，具有防止脑神经老化、抗癌、软化血管、增强机体自身免疫、清除自由基和体内有害物质等功能[5-6]。蓝靛果学名为蓝靛果忍冬（Lonicera caeruleaL.），富含花色苷、蓝靛果多糖等成分[7]，具有抗肿瘤、抗氧化[8]、降低胆固醇含量、促进血液循环等功效[9]。不老莓学名为黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa（Michx.）Ell.），富含花青素、黄酮等多酚类物质[10]，具有一定的清除自由基能力[11]、对预防癌症、心血管疾病、慢性炎症等有一定的作用[12-13]。研究表明，将果实加工成果酒有利于保持原果实中的营养成分及功效活性[14]。

目前已有学者对蓝莓果酒、蓝靛果、黑果腺肋花楸果酒分别进行了营养成分和抗氧化活性的研究，陈亮等[15]研究了发酵期间蓝莓果酒总酚含量、花色苷含量、自由基清除率以及还原力的变化并对其进行相关性分析。梁慧等[16]发现随着发酵时间的延长，蓝莓果酒的抗氧化能力逐渐减小。薛桂新[17]对陈酿期间不同蓝莓添加量的蓝靛果复合果酒的抗氧化能力的变化趋势进行了研究，发现其抗氧化活性有所差异，且随着陈酿时间的延长蓝靛果蓝莓复合果酒抗氧化能力下降。魏春雨等[18]研究了不同酿酒酵母对黑果腺肋花楸果酒成分的影响，结果表明，不同酵母菌发酵的黑果腺肋花楸果酒中香气物质含量有所差异。然而鲜有关于这3种果酒在营养成分及抗氧化活性方面的差异性的研究报道。

本研究选用蓝莓、蓝靛果及不老莓发酵酿制成果酒，测定其理化指标、单体酚类物质含量、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟基自由基（·OH）、2,2-连氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基、超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率，探究5种浆果果酒抗氧化活性的差异，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）对其进行综合评价。以期为蓝莓、蓝靛果、不老莓果酒的加工和开发提供技术依据，为更好地利用长白山地区浆果资源提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

野生蓝莓（blueberry）、栽培蓝莓（北陆）：长白山地区安图县；野生蓝靛果（Lonicera caeruleaL.）、栽培蓝靛果（蓓蕾）和不老莓（Aronia melanocarpa（Michx.）Ell.）：长白山地区汪清县；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司。

1.1.2 试剂

维生素C、DPPH、无水乙醇、ABTS、过硫酸钾、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，THAM）、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、铁氰化钾、三氯乙酸（tri-chloroaceticacid，TCA）、氯化铁、苯酚、浓硫酸、福林试剂、无水碳酸钠（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；没食子酸、（+）-儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、白藜芦醇、槲皮素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；果胶酶（酶活30 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；纤维素酶（酶活10 000 U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司。

1.2 仪器与设备

BSA124S-CW电子分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；TDZ5-WS高速离心机：湖南湘仪实验仪器有限公司；WY-055型手持糖度仪：长春市第四光学仪器厂；PHS-3C型酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV1101紫外分光光度计：上海新茂仪器有限公司；LC-2010A高效液相色谱仪：日本岛津公司；C18Elipse Plus色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浆果果酒工艺操作要点

操作要点：

浆果预处理、破碎打浆：选无腐烂、成熟度一致的果实，将果实破碎。

酶解、调整糖度：加入0.05%的果胶酶与0.1%纤维素酶在温度25 ℃时酶解2 h，加入白砂糖，调整果浆糖度至21.5～22°Bx。

活化酵母：取果实质量0.02%的果酒酿酒酵母，按1∶20的比例加入38 ℃的温水，放入38 ℃恒温水浴锅中活化30 min。

主发酵：在25 ℃左右室温发酵7～10 d，当酒精度为12%vol左右时，发酵结束，采用40目滤酒器过滤。

后发酵：将果酒酒液在室温（25 ℃）发酵1个月。

常温贮存：后发酵结束后在室温（20～25 ℃）贮藏3个月即得浆果果酒，备用。

1.3.2 理化指标的测定

取2.0 mL果酒，用蒸馏水稀释配制40 μL/mL的果酒稀释液50 mL，稳定后放置，用于理化指标的测定，操作全程避光。

总糖含量的测定：参考刘志明等[19]的苯酚-硫酸法。

总酸含量的测定：参考杨宇驰等[20]的方法。

多酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteu法[21]，以没食子酸作为标准品进行定量。

总黄酮含量的测定：参考郑娇等[22]的方法，以芦丁作为标准品进行定量。

总花色苷含量的测定：参考李安等[23]的方法。

1.3.3 单体酚类物质含量的测定

单体酚类物质含量的测定参照孙翔宇等[24]的方法，方法略有改动。取浆果果酒样品25 mL于3 000 r/min离心10 min后，取上清液10 mL，以2倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，35 ℃条件下减压浓缩至干，以5 mL甲醇复溶，过0.22 μm滤膜后进样分析。

色谱条件：采用C18Elipse Plus色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配备紫外（ultra violet，UV）检测器。采用二元梯度洗脱：流动相A为乙腈-冰乙酸（98∶2，V/V），流动相B为水-冰乙酸（98∶2，V/V）。洗脱程序为：0～60 min，A流动相5%～15%；60～65 min，A流动相15%；65～66 min，A流动相15%～20%；66～73 min，A流动相20%；73～74 min，A流动相20%～30%；74～80 min，A流动相30%；80～81 min，A流动相30%～40%；81～93 min，A流动相40%；93～98 min，A流动相40%～5%；98～103 min，A流动相5%。柱温：30 ℃，流速：0.8 mL/min，进样量：20 μL。

定性定量分析：根据各标准品的出峰时间定性，根据外标法定量。

1.3.4 抗氧化活性的测定

DPPH·清除率：参考MAU J L等[25]的方法进行测定。

ABTS+·清除率：参考LIU X Y等[26]的方法进行测定。

·OH清除率：参照程宏桢等[27]的方法并改动，改动如下：考虑到提取物本身具有颜色会产生一定的吸光度值，因此，以样品水提液1mL、10mmol/LFeSO41mL和10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL 和1 mL蒸馏水测定的吸光度值作为本底值。

O2-·清除率：参照吕闻明[28]的方法并改动，改动如下：取样品水提液0.2 mL，加入50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）5.6 mL，在25 ℃水浴中混合反应20 min，立即加入3 mmol/L邻苯三酚溶液0.2 mL。

还原力：参照乌日娜等[29]的方法进行测定。

1.3.5 数据处理

运用SPSS 25.0软件对结果进行显著性分析，对5种浆果果酒的抗氧化活性指标进行主成分分析，根据各主成分因子得分系数和方差贡献率计算综合得分[30]。

2 结果与分析

2.1 5种浆果果酒的理化指标对比

5种浆果果酒的理化指标测定结果见表1。

表1 5种浆果果酒的理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of 5 kinds of berry wines

由表1可知，两种蓝莓果酒、两种蓝靛果果酒之间总糖含量不存在显著性差异（P＞0.05），不老莓果酒总糖含量只与野生蓝靛果果酒存在显著性差异（P＜0.05），与其他样品均不存在显著性差异（P＞0.05）；5种浆果果酒的总酸、多酚、总黄酮、总花色苷含量均存在显著性差异（P＜0.05）。其中野生蓝靛果果酒的总糖、总酸、多酚、总黄酮、总花色苷含量最高，分别为1.55%、3.82%、9.69 mg/g、12.58 mg/g、1.21 mg/g，北陆蓝莓果酒的总糖、总酸、多酚及总黄酮含量最低，分别为0.51%、0.99%、1.09 mg/g、2.38 mg/g、0.01 mg/g，不老莓果酒的总花色苷含量最低（0.01 mg/g）。

2.2 5种浆果果酒的单体酚类物质含量对比

由表2可知，5种浆果果酒中野生蓝靛果果酒的咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、对香豆酸、芦丁含量最高，分别为66.19 mg/g、878.09 mg/g、13.28 mg/g、735.50 mg/g、275.32mg/g、23.86mg/g，显著高于其他果酒（P＜0.05）；野生蓝莓果酒没食子酸、阿魏酸、白藜芦醇含量分别为21.94 mg/g、7.52 mg/g、52.68 mg/g，显著高于其他果酒（P＜0.05）。5种浆果果酒10种单体酚类物质中儿茶素和绿原酸含量明显高于单体酚类物质中其他物质（P＜0.05），且野生果实发酵的果酒单体酚类物质含量均高于人工种植果实发酵的果酒。在相同发酵条件下，5种果酒的化合物含量变化趋势一致。因此，造成单体酚类物质中各成分含量有差异的原因在于果实本身所含成分。而野生果实发酵的果酒中单体酚类物质各成分含量高于人工种植果实发酵的果酒的原因可能与生长条件（土壤、光照等）有关，且在人工育种时，主要考虑人们对果实喜好的口感，导致一定的单体酚类物质成分损失。因此，综合考虑，野生蓝靛果果酒所含单体酚类物质含量更高。

表2 5种浆果果酒单体酚类物质含量Table 2 Contents of monomer phenols in 5 kinds of berry wines

2.3 5种浆果果酒的抗氧化活性对比

2.3.1 5种浆果果酒的DPPH·清除率

5种浆果果酒的DPPH·清除率见图1。

图1 5种浆果果酒DPPH·清除率的比较Fig.1 Comparison of DPPH·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由图1可知，5种浆果果酒DPPH·清除率均存在显著性差异（P＜0.05），按照DPPH·清除率的高低对不同果酒排序为：野生蓝靛果果酒（92.29%）＞蓓蕾蓝靛果果酒（81.64%）＞野生蓝莓果酒（64.80%）＞不老莓果酒（44.36%）＞北陆蓝莓果酒（20.51%）。这与浆果果酒多酚含量的结果一致。由于浆果果酒中含有多酚和黄酮类的抗氧化活性成分，对DPPH·具有一定的清除率，且多酚、黄酮含量高的浆果果酒对DPPH·清除率高[31]。因此，野生蓝靛果果酒的DPPH·清除率最好。

2.3.2 5种浆果果酒的ABTS+·清除率

5种浆果果酒的ABTS+·清除率见图2。

图2 5种浆果果酒ABTS+·清除率的比较Fig.2 Comparison of ABTS+·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由图2可知，野生蓝靛果果酒（96.13%）与野生蓝莓果果酒（96.77%）、不老莓果酒（96.05%）的ABTS+·清除率不存在显著性差异（P＞0.05），均与其他果酒存在显著性差异（P＜0.05），按照ABTS+·清除率的高低对不同果酒排序为：野生蓝莓果酒（96.77%）＞野生蓝靛果果酒（96.13%）＞蓓蕾蓝靛果果酒（94.89%）＞不老莓果酒（96.05%）＞北陆蓝莓果酒（84.63%）。有研究表明，酚类物质与抗氧化活性呈正相关[32]，由于浆果果酒中含有总花色苷以及丰富的酚类化合物，对果酒的ABTS+·清除率影响呈正相关。因此，野生蓝靛果果酒、野生蓝莓果果酒和不老莓果酒的ABTS+·的清除率最好。

2.3.3 5种浆果果酒的·OH清除率

5种浆果果酒对·OH清除率见图3。

图3 5种浆果果酒·OH清除率的比较Fig.3 Comparison of·OH scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由图3可知，野生蓝靛果果酒的·OH清除率最好，与其他果酒存在显著差异（P＜0.05）。野生蓝莓果酒和蓓蕾蓝靛果果酒·OH清除率不存在显著性差异（P＞0.05），但与其他果酒存在显著性差异（P＜0.05）。按照·OH清除率的高低对不同果酒排序为：野生蓝靛果果酒（96.28%）＞蓓蕾蓝靛果果酒（94.11%）＞野生蓝莓果酒（93.39%）＞北陆蓝莓果酒（39.98%）＞不老莓果酒（20.42%）。野生蓝靛果果酒、野生蓝莓果酒、蓓蕾蓝靛果果酒的·OH清除率显著高于北陆蓝莓果酒和不老莓果酒。有研究表明，酚羟基可以与自由基反应生成较稳定的半羟基自由基，而浆果果酒中含有丰富的酚类物质，对·OH有一定的清除能力[33]。因此，野生蓝靛果果酒的·OH清除率最好。

2.3.4 5种浆果果酒的O2-·清除率

5种浆果果酒的O2-·清除率见图4。由图4可知，5种浆果果酒中野生蓝莓果酒的O2-·清除率最强，野生蓝靛果果酒与不老莓果酒的O2-·清除率不存在显著性差异（P＞0.05），但与其他三种果酒均存在显著性差异（P＜0.05）。按照O2-·清除率的高低对果酒进行排序为：野生蓝莓果酒（50.54%）＞不老莓果酒（33.45%）＞野生蓝靛果果酒（33.27%）＞北陆蓝莓果酒（32.19%）＞蓓蕾蓝靛果果酒（25.18%）。浆果果酒中多酚类物质含量丰富，多酚是多羟基酚类衍生物的混合物，多以结合酚形式存在，黄酮类化合物具有共轭双键结构，其易发生聚合、缩合、水解及氧化反应等，对O2-·有一定的清除能力[34]。因此，野生蓝莓果酒的O2-·清除率最好。

图4 5种浆果果酒O2-·清除率的比较Fig.4 Comparison of O2-·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

2.3.5 5种浆果果酒的还原力

5种浆果果酒的还原力见图5。由图5可知，5种浆果果酒还原力均存在显著性差异（P＜0.05），按照还原力大小对不同果酒进行排序为：野生蓝靛果酒（1.744）＞蓓蕾蓝靛果酒（0.975）＞野生蓝莓果酒（0.817）＞不老莓果酒（0.469）＞北陆蓝莓果酒（0.198），这与DPPH·清除率的趋势一致。

图5 5种浆果果酒的还原力的比较Fig.5 Comparison of the reducing power of 5 kinds of berry wines

对图1～图5进行综合分析，5种浆果果酒的4种自由基的清除率和还原力表现出的抗氧化活性不同，其中野生蓝靛果果酒抗氧化活性较强，北陆蓝莓果酒抗氧化活性较弱；野生品种果酒的抗氧化活性显著高于栽培品种（P＜0.05）。

2.4 5种浆果果酒的抗氧化活性主成分分析

抗氧化活性指标主成分分析载荷图见图6，特征值与累计贡献率见表3，载荷矩阵见表4。

表3 浆果果酒抗氧化活性指标主成分的特征值与累计贡献率Table 3 Characteristic value and cumulative contribution rate of the antioxidant activity evaluation factors of berry wines

表4 抗氧化活性指标主成分载荷矩阵Table 4 Principal component load factor of antioxidant activity indexes

由图6可知，DPPH·、ABTS+·、·OH和还原力与O2-·有着明显的区分，都存在着正相关的关系，这可能是因为浆果果酒中黄酮类化合物易发生聚合、缩合、水解及氧化反应等，对O2-·清除有一定的影响，导致浆果果酒对O2-·的清除能力与其他4种自由基有着一定的区别，即DPPH·、ABTS+·、·OH和还原力对5种浆果果酒抗氧化活性具有主要贡献率。

图6 抗氧化活性指标主成分分析载荷图Fig.6 Main components loading diagram of antioxidant activity of 5 kinds of berry wines

由表3和表4可知，主成分1的特征值为3.190，方差贡献率为63.81%，主成分2的特征值为1.092，方差贡献率为21.83%，累计方差贡献率为85.64%，保留了绝大多数的原始信息。以2个主成分代表原来5个抗氧化活性指标，建立不同样品抗氧化活性的评价模型，得出以下抗氧化活性指标的线性关系式，

由公式（1）和表4可知，DPPH·、还原力、·OH、ABTS+·对5种浆果果酒抗氧化活性具有主要贡献率。为能够反映出5种不同果酒的抗氧化活性差异，以2个主成分的得分及权重构造抗氧化活性指标的评价函数F综表达式见公式（3），得到的浆果果酒抗氧化活性综合得分及排名见表5。

表5 5种浆果果酒抗氧化活性综合得分及排名Table 5 Comprehensive score and rankings of 5 kinds of berry wines

由表5可知，野生蓝莓果酒、野生蓝靛果果酒和蓓蕾蓝靛果果酒综合得分较高且均为正数，抗氧化活性较好，分别排名1、2、3，不老莓果酒、北陆蓝莓果酒综合得分为负，抗氧化活性较低，分别排名4、5。

3 结论

5种浆果果酒中野生蓝靛果果酒的总糖、总酸、多酚、黄酮、花色苷的含量最高，单体酚类物质中咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、对香豆酸、芦丁含量最高。野生蓝靛果果酒的DPPH·清除率（92.29%）、·OH清除率（96.28%）和还原力（1.744）最强；野生蓝莓果酒的ABTS+·清除率（96.77%）和O2-·清除率（50.54%）最强；通过主成分分析建立抗氧化活性指标综合评价模型，计算浆果果酒的综合得分，对5种浆果果酒的抗氧化活性排序为：野生蓝莓果酒＞野生蓝靛果果酒＞蓓蕾蓝靛果果酒＞不老莓果酒＞北陆蓝莓果酒。该研究可为蓝莓、蓝靛果、不老莓果酒的加工和开发提供技术依据，为更好地利用长白山地区浆果资源提供技术指导。