复合益生菌和纤维素酶联合发酵对小麦秸秆营养品质的影响

谢全喜，侯楠楠，陈 静，崔海英，孙明杰，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂重点实验室，山东 泰安 271000）

我国作为传统的农业大国，小麦总产量位居世界第一位，其副产物小麦秸秆产量巨大[1]。前人对小麦秸秆多采用遗弃甚至焚烧等处理方式，造成资源浪费及严重的环境污染[2-3]，应因地制宜发展不同的秸秆资源化利用模式[4]。近年来，随着我国草食畜牧业如肉牛和肉羊产业的快速发展，生长所需的粗饲料量日益增加，缺口严重，开发本地粗饲料资源成为必然，小麦秸秆因资源丰富和价格低廉等优势成为必然选择[5]。但小麦秸秆质感粗硬，纤维含量较高（在30%左右），纤维素、半纤维素和木质素以复合体形式存在，难以分解[6]，且细胞壁约占秸秆组成成分的80%，动物对细胞壁的主要成分木质纤维素的利用率较低[7]。因此，需要对小麦秸秆进行特殊处理，秸秆微贮饲料是一种新型的秸秆加工处理技术，应用微生物代谢或额外添加纤维素酶降解纤维素等成分，同时将细胞内碳水化合物等物质释放出来，提高粗蛋白和维生素含量，提升小麦秸秆利用价值[8-9]。索江华等[10]研究发现，纤维素酶对小麦秸秆具有很好的降解效率，且对最适降解条件进行了优化。杨世帆等[11]研究发现，饲用复合菌剂黄贮玉米秸秆降低中性洗涤纤维含量，提高饲料中活菌数和乳酸含量。王婷[9]研究发现，对小麦秸秆经益生菌发酵后40%代替普通麦秸饲喂绵羊，提高了干物质、中性和酸性洗涤纤维的表观消化率，提高了绵羊的生长性能。因此，本研究拟使用复合益生菌（植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）∶戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）∶酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）=3∶1∶1）和纤维素酶联合对小麦秸秆进行固体发酵，研究其对小麦秸秆营养价值和发酵品质的影响，以期为提高小麦秸秆的饲用价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 小麦秸秆和复合益生菌

小麦秸秆（在自然条件下风干，用粉碎机切至1～2 cm）、玉米面：泰安市周边农户提供；复合益生菌（植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）∶戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）∶酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）=3∶1∶1，活菌总数≥1.0×109CFU/g）：山东宝来利来生物工程股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

氢氧化钠（分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；柠檬酸铵（分析纯）：上海抚生实业有限公司；硫酸（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；硫酸镁、硫酸锰（均为分析纯）：济南汇丰达化工有限公司；乙酸钠（分析纯）：青岛捷世康生物科技有限公司；蛋白胨、酵母膏（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖（分析纯）：山东祥瑞药业有限公司；纤维素酶（酶活≥10 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司。

1.1.3 培养基

MRS固体培养基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.02%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、吐温-80 0.1%、琼脂1.5%、pH 6.0。121 ℃灭菌30 min。

孟加拉红选择性培养基和伊红美蓝培养基：青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C雷磁精密pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHP-9082数显恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：常州诺基仪器有限公司；KDN-103F自动定氮仪、HYP308消化炉：上海纤检仪器有限公司；SD120D超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SX2-4-10箱式电阻炉：龙口市电炉制造厂；LD5-2A低速离心机：北京京立离心机有限公司；LC-20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵小麦秸秆的制作

准确称取700 g小麦秸秆和50 g玉米面进行充分混匀。试验1组：添加2.0‰复合益生菌和5%的纤维素酶；试验2组：添加2.0‰复合益生菌；以不接种益生菌或纤维素酶为对照组（CK）。将水分含量调节至60%～65%，装入聚乙烯发酵袋中，用真空包装机抽真空并封口，放置32 ℃培养箱中静置发酵72 h。每组设3个重复，发酵结束后取样进行感官评定、含水率、pH值、微生物、营养成分、有机酸和挥发性盐基氮含量检测。

1.3.2 分析检测

（1）发酵小麦秸秆含水率测定及感官评定

参照GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》对发酵小麦秸秆含水率进行测定；参照地方标准DB50/T 669—2016《青贮饲料品质鉴定》的方法从气味、色泽、质地和含水率方面对发酵小麦秸秆进行感官评定。

（2）发酵小麦秸秆pH值和微生物数量测定

发酵结束后立即称取发酵样品10 g，加入90 mL蒸馏水中，用均质器拍打使其充分混匀，再进行过滤，滤液直接用pH计测定其pH值；

采用平板菌落计数法，分别检测发酵小麦秸秆中乳酸菌、大肠杆菌和霉菌数量。乳酸菌参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》；霉菌参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》；大肠杆菌参照GB 4789.38—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》。计数结果均以每克样品中的菌落数（CFU/g）表示。

（3）营养成分含量的测定

粗蛋白含量（以干物质计）参照国标GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定》中的凯氏定氮法进行测定；粗纤维（crude fiber，CF）、中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量参考范氏洗涤纤维分析法[12]测定。

（4）有机酸和挥发性盐基氮含量的测定

有机酸含量测定采用GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》中的HPLC法，其色谱条件为：InertSustain AQ-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温箱温度28 ℃，进样量20 μL，流动相为20 mmol/L的磷酸盐溶液，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm。

挥发性盐基氮含量：参照国标GB/T 32141—2015《饲料中挥发性盐基氮》中的方法进行测定。

1.3.3 数据处理

试验数据用Excel 2013软件进行初步处理后，采用SPSS 13.0进行统计分析，采用One-way ANOVA进行方差分析，最小显著差（least significant difference，LSD）法进行组间多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆感官品质的影响

发酵饲料成功的关键在于提供适宜的条件，为创造厌氧环境要把原料压实，一般将发酵饲料适宜的水分含量调整为65%～70%[13]。由表1可知，与未发酵秸秆相比，含水量无显著性差异（P＞0.05），菌酶发酵后秸秆均具有酸香味、松散不黏手且呈淡黄色。与孙贵宾等[14]研究结果一致。

表1 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆含水量及感官品质的影响Table 1 Effects of compound probiotics and cellulase on moisture and sensory evaluation of fermented wheat straw

2.2 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆pH值及微生物数量的影响

pH值是衡量发酵饲料品质的重要指标之一[15]。由表2可知，试验1组和试验2组乳酸菌活菌数均显著高于对照组（P＜0.05），且试验1组复合益生菌和纤维素酶联用，大肠杆菌未检出，pH值最低，降至3.89，霉菌活菌数低于对照2.27个数量级，说明乳酸菌是小麦秸秆发酵的关键微生物，发酵前期乳酸菌快速繁殖产生大量乳酸，使pH值迅速降低，有效抑制有害菌（大肠杆菌和霉菌）的繁殖。酵母菌发酵后可增加小麦秸秆的营养价值，改善其适口性。这与郭萌萌[16]的研究结果一致，通过添加乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等发酵玉米秸秆，降低pH值，有效控制有害菌增长。纤维素酶可降解植物细胞壁的结构性多糖为单糖，并为微生物发酵提供充分的底物，改善发酵小麦秸秆品质[17]。本试验中试验1组菌酶联合使用时乳酸菌活菌数最高，显著高于其余各组（P＜0.05），原因可能是由于纤维素酶把小麦秸秆中多糖分解成寡糖或单糖的蛋白质，为乳酸菌生长繁殖提供营养。

表2 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆pH值微生物数量的影响Table 2 Effects of compound probiotics and cellulase on pH value and microbial number of fermented wheat straw

2.3 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆营养品质的影响

纤维素酶可降解植物细胞壁的结构性多糖为单糖，为微生物生长提供充分的底物，改善饲料品质[17]。CHILSON J M等[18]研究表明，添加纤维素酶和乳酸菌可提高青贮品质，促进纤维素降解。本试验中，与对照组相比，试验1组和试验2组由于益生菌的添加，显著提高发酵小麦秸秆的粗蛋白含量（P＜0.05），其中以试验1组最高，高出对照9.56%，这可能与小麦秸秆中纤维成分的降解促进了微生物的生长，增加菌体蛋白相关，这与殷术鑫等[19]报道的添加剂的使用可以提高青贮的粗蛋白含量结果相同。与对照组相比，试验2组只使用复合益生菌发酵，显著降低粗纤维和酸性洗涤纤维含量（P＜0.05），中性洗涤纤维含量差异不显著（P＞0.05）；与对照组相比，试验1组菌酶联合发酵粗纤维、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维分别显著降低22.16%、16.42%和14.90%（P＜0.05）；与试验2组相比，试验1组使用纤维素酶和复合益生菌联合发酵，显著降低粗纤维、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量（P＜0.05）。纤维素酶对纤维成分的降解作用已被许多试验证明，由于纤维素酶的添加对小麦秸秆纤维结构产生了降解作用，造成纤维素酶和复合益生菌联合使用中粗纤维、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量的降低所致。本试验结果与毛建红[20]研究结果相一致。

表3 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆营养品质的影响Table 3 Effects of compound probiotics and cellulase on nutritional quality of fermented wheat straw

2.4 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆有机酸和挥发性盐基氮含量的影响

表4 复合益生菌和纤维素酶对发酵小麦秸秆有机酸和挥发性盐基氮含量的影响Table 4 Effects of compound probiotics and cellulase on organic acid and total volatile base nitrogen contents of fermented wheat straw

乳酸是乳酸菌代谢的产物，乳酸含量的高低在一定程度上反映发酵饲料好坏[21]，乳酸的产量直接影响发酵饲料品质，也是影响pH值的最主要因素，乳酸的产生可引起发酵饲料pH值下降，有效抑制腐败菌的生长[22]。同时乳酸具有维持肠道菌群平衡，减少腹泻，促进钙质吸收的功能[23]。本试验中试验1组和试验2组乳酸含量分别显著高于对照组5.07倍和3.12倍（P＜0.05），其中以试验1组菌酶联合发酵最高，显著高于其余各组（P＜0.05）。分析原因是由于纤维素酶降解纤维成分，为乳酸菌生长提供底物，促进乳酸菌等益生菌生长繁殖，将小麦秸秆中碳水化合物进行生物降解，转化成乳酸等有机酸。乙酸会使发酵饲料产生酸味，降低适口性，并产生刺鼻的气味。本试验中，试验1组菌酶联合发酵小麦秸秆72 h时乙酸含量与对照组差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比，试验1组菌酶联合发酵显著提高了酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量（P＜0.05）。

挥发性盐基氮主要由植物酶对蛋白质的降解和微生物分解利用蛋白质和氨基酸产生，反映蛋白质的降解程度，优质的发酵饲料应该具有较低含量的挥发性盐基氮[24]。本试验中，与对照组相比，试验1组和试验2组挥发性盐基氮含量分别显著降低57.48%和30.67%（P＜0.05），这与兴丽等[25]利用乳酸菌和纤维素酶同时添加显著降低玉米青贮的氨态氮含量结果一致，分析原因可能是乳酸菌通过降低小麦秸秆在发酵过程中蛋白质的降解作用或抑制腐败微生物的分解作用，从而降低挥发性盐基氮含量。

3 结论

复合益生菌和纤维素酶联合发酵小麦秸秆具有酸香味、松散不黏手且呈淡黄色；固体发酵72 h后pH值最低，为3.89，霉菌活菌数低于对照2.27个数量级，大肠杆菌未检出；与未发酵小麦秸秆相比，菌酶联合发酵粗纤维、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和挥发性盐基氮分别降低22.16%、16.42%、14.90%和57.48%，乳酸含量提高了5.07倍。在本试验条件下，该菌酶复合制剂发酵小麦秸秆可显著提高其发酵品质和营养价值，为黄贮小麦秸秆添加剂的开发提供理论依据。