基于HS-GC-IMS分析樱桃酒中的挥发性风味物质

刘宝祥，苏政波 *，马 闯，刘建军

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省食品发酵工业研究设计院 山东省食品发酵工程重点实验室，山东 济南 250013；2.哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

樱桃的营养非常丰富、味道鲜美，富含糖、维生素、氨基酸、有机酸和矿物质等成分[1-2]。此外，樱桃中还含有类黄酮、抗坏血酸、酚类、花青素等营养健康成分[3-4]。我国种植樱桃品种主要为甜樱桃（Prunus aviumL.）、酸樱桃（Prunus cerasusL.）、中国樱桃（Prunus pseudocerasusL.）和毛樱桃（Prunus tomentosaThunb），主要樱桃产地为山东省、江苏省和四川省[5]。由于樱桃水分含量高，皮薄、肉软，组织娇嫩，采摘后不易储存，导致樱桃极易变味、变质而失去价值[6]。随着樱桃产量的增加、人们对产品质量要求的提高，开发樱桃酒等高附加值、易储存的产品成为一种趋势。

风味是评价食品质量的重要指标，也是樱桃酒最重要的特征和品质之一。樱桃中的主要风味物质为己烯醛、2-己烯-1-醇、乙醇、2-丙酮、乙醛、己醛、苯甲醛和苯甲醇[1]。经过酵母菌发酵后，樱桃酒的风味成分变得更为复杂。在樱桃酒中，可以检测到许多成分：如氨基酸、微量元素、有机酸、酚类和风味物质等。风味物质是评价食品质量的基本感官指标之一，影响着最终产品的质量。酒的风味受到原料、菌种、发酵工艺、熟化过程等多种因素的影响[5，7-9]。在过去的研究中，数千种风味物质可以在果酒中被检测到，但只有很少能够达到气味阈值并被闻到。NIU Y W等[10]通过固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）结合气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，从樱桃酒中检出24种成分；结合气相色谱-嗅闻技术（gas chromatography olfactometry，GC-O），确定了7种主要挥发性成分。SUN S Y等[11]利用顶空固相微萃取结合气质联用，从樱桃酒中检出21种挥发性成分，包括6种酯类、2种醇类、6种萜类和1种酚类等。通过应用顶空固相微萃取（headspacesolid phase microextraction，HS-SPME）、气相色谱（gas chromatography，GC）、气相色谱-质谱联用、顶空-气相色谱或氢火焰离子化检测器（headspace-gas chromatography/flame ionization detector，HS-GC/FID）等技术手段，根据其所含的风味物质成分，分析原料、菌种、发酵方式和熟化过程等对樱桃酒品质的影响，并评价其质量[12-15]。

离子迁移谱（ion mobility spectrometry，IMS）是一种能够单独检测气体混合物的分析仪器，具有小巧、轻便、灵敏、所需样品少的特点[16-17]。通过与气相色谱联用后，经过气相色谱柱的初次分离，随后进入离子迁移管，待测分子在电离区带电后，在电场和逆向漂移气的作用下迁移到达检测器检测，实现二次分离。它结合了二者优势，无需预处理、分辨率较高，仅需3～5 min就可以完成样品的检测[18]。在食品分类和掺假检测、食品新鲜度和腐坏度评价、异味检测、食品加工过程监测、食品贮藏等过程中香气变化评价具有极大的优势[19]。本实验以山东日照产新鲜樱桃发酵而成樱桃酒，通过顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）研究樱桃酒的挥发性风味成分，为理论研究和相关企业开发樱桃产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樱桃：山东省日照市五莲山“红灯”樱桃；白砂糖：市售。

果胶酶（酶活力1 000 U/g）：诺维信生物技术有限公司；果酒酵母：湖北安琪酵母有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）；产品用水为纯净水。

1.2 仪器与设备

CTC CombiPAL自动顶空进样器：瑞士CTC Analytics AG公司；FlavourSpec气相离子迁移谱、食品风味分析与质量控制系统（Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析软件及GC×IMS Library Search Software定性软件）：德国G.A.S公司；MJ-BL1052A料理机：广东美的生活电器制造有限公司；L550低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；HPX-200生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；HH-6电热恒温水浴锅：北京医疗设备厂；AE 200电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樱桃酒制作基本工艺与操作要点

新鲜樱桃→拣选→清洗→除梗→去核→打浆→酶解→加糖→接种酵母菌→发酵→去渣→澄清→樱桃酒

操作要点：

取适量新鲜樱桃，去除其中的坏果、腐烂果和其他杂物，选择成熟度良好、颜色深的新鲜樱桃；手工摘除樱桃的果梗，再去掉樱桃核，将处理好的樱桃加入料理机，直接将樱桃进行破碎、打浆；打浆好的樱桃，加热至50 ℃，加入一定量果胶酶，保温并保持搅拌2 h；酶解过的樱桃浆，加入15%白砂糖并溶解[20]，加入0.03%焦亚硫酸钠，搅拌均匀，接种0.05%果酒酵母，于23 ℃条件下，保持静置发酵7 d，至酒精度不再升高；发酵结束后使用离心机于4 000 r/min离心10 min，得到上层清液；经检测，酒精度为12.51%vol，还原糖含量9.7 g/L。

1.3.2 理化指标的测定

残糖量的测定：按照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》执行[21]；酒精度的测定：按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》执行[22]。

1.3.3 HS-GC-IMS分析条件

顶空孵育温度：35 ℃；孵育时间：10 min；孵育转速500 r/min；顶空进样针温度：40 ℃；进样体积：100.0 μL；色谱柱：FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱温：60 ℃；IMS温度：45 ℃；载气：高纯氮气（N2）（纯度≥99.999%）。

1.3.4 樱桃酒中风味物质的特征化合物的香气特征测定

基于LAV软件的GalleryPlot插件，确定樱桃酒中挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs）图谱，经过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库和IMS数据库对物质定性分析，得到挥发性化合物的定性数据和峰面积数据，结合文献对化合物的描述[23-24]，确定樱桃酒中风味物质的特征化合物的香气特征。

2 结果与分析

2.1 樱桃酒风味物质图谱分析

樱桃酒挥发性物质的GC-IMS三维图谱见图1，坐标分别代表保留时间，迁移时间和峰强度，每个峰信号代表一种挥发性化合物，三维图中可以直观看出挥发性有机物。根据保留时间和迁移时间可以鉴定出挥发性化合物的种类，峰强度则可以比较化合物浓度的差别。

图1 樱桃酒中挥发性物质三维离子迁移谱Fig.1 Three-dimensional (3D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine

樱桃酒中挥发性物质二维图谱见图2，由图2可以看出：樱桃酒中的主要挥发性物质在迁移时间0.8～1.8 ms，保留时间200～800 s的范围内。通过HS-GC-IMS在樱桃酒中检出38种物质，对应鉴定出23种挥发性有机物。

图2 樱桃酒中挥发性物质二维离子迁移谱Fig.2 Two-dimensional (2D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine

2.2 樱桃酒中的风味物质分析

通过HS-GC-IMS检出的物质和相关参数见表1，结果表明，樱桃酒中共检出23种挥发性化合物，其中酯类9种，分别为辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸乙酯；醛类4种，分别为苯甲醛、糠醛、丙醛和戊醛；醇类5种，分别为己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇和丙醇；酮类3种，分别为3-羟基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮和丙酮；此外，还有部分2,6-二甲基吡嗪和乙酸存在。

表1 GC-IMS检测樱桃酒中的挥发物参数Table 1 GC-IMS integration parameters of volatile compounds in cherry wine

续表

樱桃酒的酯类成分尤为丰富，之前的报道中[12-14，25]，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸异丁酯为樱桃酒中的主要挥发性化合物，异丁酸乙酯和乙酸丙酯的相对含量较低，其中丙酸乙酯和乙酸异丁酯未有在樱桃酒检测到的报道。醇类成分中，不考虑乙醇的存在，3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和丙醇是樱桃酒中的主要醇类风味物质，主要在酒精发酵过程中产生，与先前的报道一致[13]，丁醇和己醇的相对含量较低。高级醇（包括丙醇、异丁醇、异戊醇和戊醇等）对酒类产品的风味有很大的影响，主要由酿酒酵母通过Ehrlich循环或糖酵解途径水解支链氨基酸产生[26]。高级醇的产生和含量的高低受到很多因素的影响，包括发酵温度、氨基酸浓度、发酵罐尺寸和陈酿条件等[27-28]。苯甲醛主要来自于樱桃果实中[29]，糠醛和戊醛主要产生于酵母菌发酵过程中。此外，4-甲基-2-戊酮、2,6-二甲基吡嗪、3-羟基-2-丁酮和丙酮作为樱桃酒中重要的风味成分，也有着重要的作用，同时风味物质中还有少量乙酸的存在。

2.3 樱桃酒挥发性成分离子峰图谱分析

基于LAV软件的Gallery Plot插件，樱桃酒中挥发性物质的VOCs图谱见图3。

图3 樱桃酒中挥发性物质Gallery Plot图谱Fig.3 Gallery Plot of volatile compounds in cherry wine

由图3可知，樱桃酒中的挥发性成分含量较高主要为丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁醇、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、4-甲基-2-戊酮和戊醛，这些成分为樱桃酒的主要挥发性风味成分。从挥发性图谱来看，2,6-二甲基吡嗪、异丁酸乙酯、乙酸、苯甲醛、糠醛、丙醛、丙醇和己醇的相对含量可能较低。

2.4 樱桃酒风味物质的香气特征分析

樱桃中香气成分十分复杂，经过发酵后带来更为丰富的风味。樱桃酒中风味物质的特征化合物和香气特征见表2，香气类型分析图见图4。由表2和图4可知，樱桃酒中的挥发性物质的香气类型主要为水果香气，包括7种果香（fruity）：己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯和苯甲醛；3种柔和果香（ethereal）：乙酸丙酯、乙酸乙酯和2-甲基丙醇；此外，其他物质也带来青草（green）、白兰地（waxy）、发酵（fermented）、烤面包（bready）、草本（herbal）、咖啡（coffee）、酒精（alcoholic）、黄油（buttery）、芳香气味（solvent）、巧克力（chocolate）、酸味（acidic）等香气，这些挥发性成分共同组成了樱桃酒香气的风味和特征。

表2 樱桃酒中风味物质的香气成分及特征Table 2 Aroma components and characteristics of volatile compounds in cherry wine

图4 樱桃酒香气类型分析图Fig.4 Analysis diagram of aroma types of cherry wine

构成樱桃酒风味成分的主要成分为酯类和醇类，酯类主要赋予樱桃酒新鲜的水果香气，乙醇和高级醇类赋予了樱桃酒的酒精味道和其他复杂风味。香气特征为水果香的物质除了苯甲醛外，其他全部为酯类。苯甲醛主要来自于樱桃果实中，酯类主要为乙酸酯和脂肪酸乙酯，主要产生于发酵中期，来自醇类和酰基辅酶A的缩合反应[30]。其他挥发性成分作为酿酒酵母的发酵产物，为樱桃酒带来青香、蜡香、咖啡味、巧克力和酸味等其他风味，使酒体的风味构成更为丰富。

3 结论

以新鲜樱桃发酵生产樱桃酒，通过HS-GC-IMS分析樱桃酒的挥发性风味成分，获得樱桃酒的挥发性物质图谱。樱桃酒中共检出23种挥发性化合物，其中，酯类9种，醇类5种，醛类4种，酮类3种，吡嗪类1种和有机酸1种。结合樱桃酒挥发性物质图谱和软件分析，确定为辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、苯甲醛、糠醛、丙醛、戊醛、己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羟基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮、丙酮、2,6-二甲基吡嗪和乙酸为樱桃酒中的主要风味物质。其中，仅有苯甲醛和丙醛在樱桃中存在，其他大部分由酿酒酵母在樱桃酒发酵过程中产生。经过樱桃酒的香气特征分析，樱桃酒的香气特征主要为果香和柔和果香，其他物质也带来青香、蜡香、发酵香、烤面包香气、咖啡、酒精、黄油、芳香气味、巧克力、酸味等香气，这些挥发性成分共同组成了樱桃酒的风味和特征。