益心泰有效组分对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌组织CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表达水平的影响研究

李雅，魏佳明，李玉莹，郭志华

随着社会节奏加快和人口老龄化的加剧，心力衰竭在世界范围造成的威胁日趋严重［1］。扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是心力衰竭形成的主要原因之一［2］。研究显示，钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）与扩张型心肌病心力衰竭形成机制密切相关［3-4］。CaN受心肌细胞［Ca2+］i浓度调节，而肌浆网钙泵（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a） 作为钙转运的关键酶，可以影响心肌细胞［Ca2+］i浓度。益心泰为临床科研方，由黄芪、红花、丹参、泽泻、猪苓等药伍用而成，功在益气活血利水。前期研究表明，益心泰具有较好的抗心力衰竭作用［5-6］，其能改善气促、疲倦、乏力、纳呆等临床症状，提高生活质量，且安全、有效，但其机制尚待进一步明确。中药复方有效组分效应机制研究是当前一大热点，有助于揭开复方有效的神秘面纱，更好地发挥中医药治疗慢性疾病的优势作用［7］。本研究拟采用兔扩张型心肌病心力衰竭模型为研究对象，观察益心泰有效组分（effective components of Yixintai，ECYXT）干预后的兔心肌组织形态学，血清心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）水平，左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）和E峰与A峰的比值（E/A比值）等心功能情况，心肌细胞［Ca2+］i浓度，以及心肌组织CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表达水平等的变化，深入研究ECYXT对兔扩张型心肌病心力衰竭模型的作用机制，为中医药防治扩张型心肌病心力衰竭提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2018年1月，选取120只健康新西兰兔，普通级，重1.5～2.0 kg。于湖南太平生物科技有限公司购入，动物许可证编号：SCXK（湘）2015-0004，合格证号：NO.43608300000615，不限制食水，通风，室温约23 ℃，湿度50%～60%，正常光/暗周期，分笼饲养。本研究经湖南中医药大学动物实验伦理审查委员会批准（批准号：LL2018010801）。

1.2 实验药物 ECYXT：黄芪、丹参、红花、猪苓、泽泻等购于湖南中医药大学第一附属医院，按照3.0∶1.0∶1.5∶1.0∶1.0进行配比，采用系统溶剂法与大孔树脂吸附法相结合，对益心泰复方中四个不同极性部位的药效组分进行分离，根据最佳工艺条件，分离得到ECYXT提取液，冷冻干燥后获得提取物（含总皂苷372.4 mg/g、总黄酮98.3 mg/g、总多糖445.8 mg/g）；氯沙坦钾：50 mg/片（杭州默沙东制药有限公司，H20000371）；丙基硫氧嘧啶：50 mg/片（苏州东瑞制药有限公司，H32020795）；乌拉坦（Sigma，94300）；0.9%氯化钠溶液：500 ml/瓶（四川科伦药业股份有限公司，H51021158）。

1.3 实验试剂与仪器 多聚甲醛（Sigma，16005）；苏木精（Sigma，H9627）；伊红（Sigma，E4009）；石蜡（河南天孚化工有限公司）；ANP ELISA检测试剂盒（江莱生物，货号：JL22215）；BNP ELISA检测试剂盒（eBioscience，货号：XY-1900）；CaN抗体（Abcam，货 号：ab3673）；SERCA2a抗 体（Abcam， 货 号：ab2861）；GAPDH抗体（Abcam，货号：ab181602）；RIPA裂解液（北京索莱宝生物科技有限公司）；甲基磺 酰 氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（ 北京索莱宝生物科技有限公司）；BSA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）；反转录试剂盒（Takara，货号：RR047A）；Trizol（Invitrogen，货号：15596-026）；SYBR Premix EX Taq TM Ⅱ（Takara，货号：DRR820A）；超声心动图机（西门子公司，货号：Sequoia 512）；FV3000激光扫描共聚焦显微镜（OLYMPUS公司）；钙荧光探针Fluo3/AM（碧云天， 货 号：S1056）；Pluronic-F127（Sigma， 货 号：P2443）；DYY-7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；SYSTEM GelDoc XR+凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；iQ5实时荧光定量 PCR仪（Bio-Rad公司）。

1.4 动物分组及模型制备 参考文献［5，8］，以阿霉素耳缘静脉注射+丙基硫氧嘧啶灌胃复制兔扩张型心肌病心力衰竭模型。根据随机数字表法，将20只实验兔作正常对照组，其余100只进行造模处理。固定兔于手术台，模型兔予以丙基硫氧嘧啶灌胃，剂量按兔每日进食量的0.2%，1次/d；并分别于每周三、周日下午耳缘静脉注射阿霉素溶液1 mg/kg，浓度为1 mg/ml。正常对照组予以等次等量的0.9%氯化钠溶液灌胃及耳缘静脉注射。连续造模8周。造模后第1天，行心脏超声检测显示模型兔LVEF、LVFS、E/A比值较正常对照组显著下降，伴有精神萎靡、水肿、抓起反抗下降、心率和呼吸频率加快、耳温降低及尿量减少等心力衰竭表现，提示造模成功。造模过程中，模型兔共死亡16只，均死于腹泻。将造模成功的模型兔按完全随机设计方法分为心力衰竭模型组（17只）、ECYXT低剂量组（17只）、ECYXT中剂量组（17只）、ECYXT高剂量组（17只）和氯沙坦钾组（16只）。

1.5 干预方法 于造模后第1周开始灌胃，根据成人体表面积换算法，结合临床用药经验和既往实验研究，确定ECYXT低、中、高剂量组浓度分别为2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg（相当于临床剂量的2、4、8倍），给药前予以蒸馏水稀释后灌胃。氯沙坦钾组（制成氯沙坦钾悬液）2.75 mg/kg，正常对照组与心力衰竭模型组灌服同等容积的蒸馏水。6组灌胃量均为每次10 ml/kg，1次/d，连续4周。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 一般情况 观察兔毛色、精神状态、心率、呼吸频率、耳温、尿量、水肿等一般情况。

1.6.2 血清ANP、BNP水平检测 采用ELISA法检测血清ANP、BNP水平。麻醉兔，心脏采血，静置，离心，稀释，过夜，洗涤。加入待测血清样品，反复孵育，洗涤，最后每孔加入0.05 ml 2M H2SO4，终止反应。使用酶标仪检测450 nm处的光密度（OD）值并记录。

1.6.3 心脏超声检测 麻醉满意后将兔平卧位固定，运用西门子Sequoia 512超声心动图机，探头频率3～8 MHz，取心前区左心室长轴最大直径处，M型超声标记室间隔和左心室后壁收缩末与舒张末期心内膜位置，随机软件自动计算兔LVEF、LVFS及E/A比值等指标，取5个心动周期读数平均值。

法国的成人教育有悠久的历史。法国成人教育的创始人是法国著名哲学家、政治家和数学家孔多塞（Condorcet）。早在1792年4月法国大革命期间，孔多塞作为共和党人，向宪法事务委员会提出永久教育意义上的公共教育。孔多塞认为，所有人应享有普及、平等和永久教育的权利，同时，永久教育也必须被视为每个公民对社会的责任［1］。孔多塞的教育思想奠定了法国成人教育的基本理念之一——通过传递全面的知识体系，使成人能够获得正规的教育资格，从而成为专业人士［2］。

1.6.4 心肌组织形态学检查 4%多聚甲醛固定组织，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片（厚4～5 μm），烤片，HE染色，光镜观察并采图。

1.6.5 心肌细胞［Ca2+］i浓度 采用荧光负载法测定。酶解法分离心肌细胞，2 000 rmp/min离心10 min后，弃上清液，细胞沉淀重悬于Joklik培养基，并放入培养瓶中，清洗细胞3次以无菌D'-Hanks液，添加Fluo3/AM（终浓度4 μm）和Pluronic-F127（终浓度0.05%），轻微震荡孵育45 min，37 ℃，去除负载液，启动共聚焦扫描显微镜，488 nm激光扫描，计算数据公式：［Ca2+］i=Kd〔（R-Rmin）/（Rmax-R）〕（Fmin/f=Fmax），其中Kd为解离常数，F为样品的荧光强度值。

1.6.6 心肌组织CaN及SERCA2a蛋白检测 采用Western blot法测定，液氮研磨心肌组织后，加入裂解液并置于冰上20 min使其充分裂解后，在4 ℃和12 000 rmp/min离心15 min后，保留上清液，用BCA法定量蛋白，制备SDS-PAGE浓缩胶与分离胶，上样，电泳，转膜，封闭，配一抗，上一抗（1∶500），上二抗（1∶2 000），显影成像，利用Quantity-One图像分析软件分析各样品目的条带的灰度值，以看家基因GAPDH为内对照，计算CaN及SERCA2a蛋白条带与GAPDH条带灰度值之比，并将基础数值（正常对照组）设置为1进行比较，从而得出各组最后结果。

1.6.7 心肌组织CaN及SERCA2a mRNA检测 RTPCR法测定心肌组织CaN及SERCA2a mRNA水平，用TRIzol法提取总RNA，测OD值，检验RNA纯度和浓度。逆转录合成cDNA：配置逆转录反应体系（20 μl），用去离子水1∶3稀释后贮存于-20 ℃冰箱备用。引物设计与合成：CaN：F：5'-ACGGCAGACCCTACAAAG-3'；R：5'-CCCTCAAAGCCTCCATCC-3。SERCA2a：F：5'-T T C C C A C A A G T C C A A G A T-3'；R：5'-TCCTCCACAGCAGCCACCAAT-3'。PCR反应体系：配置逆转录反应体系（20 μl），置于PCR仪中，95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，步骤 2～4 循环40次，72 ℃，10 min。PCR产物长度分别为391 bp（CaN）和204 bp（SERCA2a）。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔一般情况的影响 用药后，观察到ECYXT各剂量组和氯沙坦钾组兔毛发枯槁和发黄、精神萎靡、水肿、少动少气等情况均有所改善，心率和呼吸频率较前平稳，耳温、尿量情况好转；且ECYXY中、高剂量组和氯沙坦钾组改善程度更为明显，强于ECYXT低剂量组；心力衰竭模型组无好转，并且其中部分实验兔上述症状有所加重。整个用药干预过程中，心力衰竭模型组和ECYXT低剂量组兔各死亡3只（均死于腹泻），ECYXT中剂量组兔死亡2只（均死于腹泻），ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组各死亡1只兔（均死于腹泻），正常对照组无兔死亡。

2.2 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影响 6组血清ANP、BNP水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。其中，ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组血清ANP、BNP水平均低于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组血清ANP、BNP水平均低于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组3组间血清ANP、BNP水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影响（±s，ng/ml）Table 1 Effects of effective components of Yixintai on serum ANP and BNP levels in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表1 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影响（±s，ng/ml）Table 1 Effects of effective components of Yixintai on serum ANP and BNP levels in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：ECYXT=益心泰有效组分，ANP=心钠肽，BNP=脑钠肽；与心力衰竭模型组比较，aP＜0.01；与ECYXT低剂量组比较，bP＜0.01

组别 只数 ANP BNP心力衰竭模型组 14 155.40±4.16 60.71±1.68 ECYXT低剂量组 14 138.68±3.18a 51.92±1.50a ECYXT中剂量组 15 126.98±3.09ab 49.30±1.93ab ECYXT高剂量组 16 125.03±3.54ab 48.37±1.33ab氯沙坦钾组 15 124.69±3.26ab 48.25±1.43ab正常对照组 20 62.19±1.67ab 34.22±0.96ab F值 1 808.587 581.42 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心脏超声指标的影响 6组LVEF、LVFS和E/A比值比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。其中，ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组LVEF、LVFS和E/A比值均高于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组LVEF、LVFS和E/A比值均高于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组LVEF、LVFS和E/A比值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心脏超声指标的影响（±s）Table 2 Effects of effective components of Yixintai on echocardiographic indices in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表2 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心脏超声指标的影响（±s）Table 2 Effects of effective components of Yixintai on echocardiographic indices in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：LVEF=左心室射血分数，LVFS=左心室短轴缩短率，E/A比值=E峰与A峰比值；与心力衰竭模型组比较，aP＜0.01；与ECYXT低剂量组比较，bP＜0.01

组别 只数 LVEF（%） LVFS（%） E/A比值心力衰竭模型组 14 37.26±1.06 24.87±0.71 0.60±0.02 ECYXT 低剂量组 14 49.08±1.36a 29.47±0.82a 0.68±0.02a ECYXT 中剂量组 15 59.93±1.98ab 33.99±0.97ab 1.22±0.03ab ECYXT 高剂量组 16 60.96±1.65ab 34.10±0.97ab 1.23±0.04ab氯沙坦钾组 15 61.14±1.60ab 34.68±1.26ab 1.24±0.03ab正常对照组 20 70.08±1.99ab 40.36±0.94ab 1.49±0.04ab F值 744.73 483.21 1 940.07 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心脏组织形态学的影响 心力衰竭模型组心肌细胞损伤出现水肿、坏死，胞核皱缩，间质变宽，少许炎性细胞浸润，心肌纤维排列紊乱，部分断裂。ECYXT各剂量组和氯沙坦钾组心肌细胞损伤程度均较心力衰竭模型组有所减轻。ECYXT低剂量组心肌细胞分布紊乱，间质增宽，伴纤维断裂，少许炎性细胞浸润。ECYXT中剂量组心肌纤维排列大致正常，伴少量纤维断裂，心肌细胞轻度水肿，间质变宽，少许炎性细胞浸润。ECYXT高剂量组和氯沙坦钾组心肌纤维排列正常，未见断裂及水肿，少许炎性细胞浸润。正常对照组心肌纤维排列正常，无断裂、水肿，且间质无炎性细胞浸润，见图1。

图1 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌组织形态学的影响（HE×400）Figure 1 Effect of effective components of Yixintai on pathological changes of the myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

2.5 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌细胞［Ca2+］i浓度的影响 6组心肌细胞［Ca2+］i浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。其中，ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组心肌细胞［Ca2+］i浓度均低于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌细胞［Ca2+］i浓度均低于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组3组间心肌细胞［Ca2+］i浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌细胞［Ca2+］i浓度的影响（±s，nm）Table 3 Effect of effective components of Yixintai on the concentration of［Ca2+］i in myocardial cells of the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表3 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌细胞［Ca2+］i浓度的影响（±s，nm）Table 3 Effect of effective components of Yixintai on the concentration of［Ca2+］i in myocardial cells of the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：与心力衰竭模型组比较，aP＜0.01；与ECYXT低剂量组比较，bP＜0.01

组别 只数 ［Ca2+］i心力衰竭模型组 14 219.77±6.38 ECYXT低剂量组 14 182.94±5.08a ECYXT中剂量组 15 157.88±3.17ab ECYXT高剂量组 16 156.57±3.61ab氯沙坦钾组 15 155.08±4.29ab正常对照组 20 94.94±2.23ab F值 605.78 P值 ＜0.001

2.6 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a蛋白表达水平的影响 6组心肌组织CaN及SERCA2a蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。其中，ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组心肌组织CaN蛋白表达水平低于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌组织CaN蛋白表达水平低于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组心肌组织CaN蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.01）；ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组心肌组织SERCA2a蛋白表达水平高于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌组织SERCA2a蛋白表达水平均高于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌组织SERCA2a蛋白表达水平均高于ECYXT中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT高剂量组心肌组织SERCA2a蛋白表达水平与氯沙坦钾组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、表4。

图2 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a蛋白表达水平的影响Figure 2 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表4 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a蛋白表达水平的影响（±s）Table 4 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels in myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表4 ECYXT对扩张型心肌病心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a蛋白表达水平的影响（±s）Table 4 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels in myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：CaN=钙调神经磷酸酶，SERCA2a=肌浆网钙泵；与心力衰竭模型组比较，aP＜0.01；与ECYXT低剂量组比较，bP＜0.01；与ECYXT中剂量组比较，cP＜0.01

组别 只数 C a N蛋白 S E R C A 2 a蛋白心力衰竭模型组 1 4 4.2 6±0.2 1 0.1 7±0.0 2 E C Y X T低剂量组 1 4 2.8 8±0.1 8 a 0.2 8±0.0 3 a E C Y X T中剂量组 1 5 2.2 4±0.1 6 ab 0.3 4±0.0 3 ab E C Y X T高剂量组 1 6 2.2 1±0.1 4 ab 0.5 3±0.0 4 abc氯沙坦钾组 1 5 2.2 0±0.1 0 ab 0.5 4±0.0 5 abc正常对照组 2 0 1.0 0±0.0 7 ab 1.0 0±0.0 6 abc F值 8 6 3.9 0 8 5 4.1 0 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.7 ECYXT对心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a mRNA表达水平的影响 6组心肌组织CaN及SERCA2a mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。其中，ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组心肌组织CaN mRNA表达水平低于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌组织CaN mRNA表达水平低于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组心肌组织CaN mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.01）；ECYXT各剂量组、氯沙坦钾组和正常对照组心肌组织SERCA2a mRNA表达水平高于心力衰竭模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌组织SERCA2a mRNA表达水平均高于ECYXT低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT高剂量组、氯沙坦钾组、正常对照组心肌组织SERCA2a mRNA表达水平均高于ECYXT中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）；ECYXT高剂量组心肌组织SERCA2a mRNA表达水平与氯沙坦钾组比较，差异无统计学意义（P＞0.01），见表5。

表5 ECYXT对心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a mRNA表达水平的影响（±s）Table 5 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a mRNA expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表5 ECYXT对心力衰竭兔心肌组织CaN及SERCA2a mRNA表达水平的影响（±s）Table 5 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a mRNA expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：与心力衰竭模型组比较，aP＜0.01；与ECYXT低剂量组比较，bP＜0.01；与ECYXT中剂量组比较，cP＜0.01

组别 只数 CaN mRNA SERCA2a mRNA心力衰竭模型组 14 2.67±0.09 0.27±0.01 ECYXT低剂量组 14 2.58±0.09a 0.36±0.02a ECYXT中剂量组 15 1.68±0.07ab 0.57±0.03ab ECYXT高剂量组 16 1.67±0.08ab 0.69±0.03abc氯沙坦钾组 15 1.65±0.07ab 0.71±0.03abc正常对照组 20 1.10±0.06ab 1.06±0.08abc F值 899.65 714.33 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

扩张型心肌病是一种病因不明的异质性心脏病，目前对其机理尚不清楚，是心力衰竭常见的三大原发病之一。中医药通过整体辨证，治疗该类患者疗效得到肯定［9-10］，值得深入挖掘。

本研究采用阿霉素耳缘静脉注射+丙基硫氧嘧啶灌胃制作兔扩张型心肌病心力衰竭模型，具备操作简便、易于表现疾病特点的优势，但实验过程中兔因腹泻致死比例较高，对实验过程中所有死亡兔进行解剖，发现存在不同程度的胸腔、腹腔积液及肝脾肿大，考虑与阿霉素导致肠炎的不良反应相关。本研究实验结果显示，与正常对照组比较，心力衰竭模型组血清ANP、BNP水平升高（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值降低（P＜0.01），提示扩张型心肌病心力衰竭兔的心功能下降。与心力衰竭模型组比较，ECYXT各剂量组和氯沙坦钾组血清ANP、BNP水平降低（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值升高（P＜0.01），心肌细胞［Ca2+］i浓度及心肌组织CaN mRNA及蛋白表达水平降低（P＜0.01），心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平升高（P＜0.01），说明ECYXT能提高心功能，下调Ca2+浓度，提高心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平，降低心肌组织CaN mRNA及蛋白表达水平。且心肌组织形态学比较发现ECYXT各剂量组和氯沙坦钾组均能不同程度改善心肌细胞损伤。与ECYXT低剂量组比较，ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组和氯沙坦钾组血清ANP、BNP水平降低（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值升高（P＜0.01），心肌细胞［Ca2+］i浓度及心肌组织CaN mRNA及蛋白表达水平降低（P＜0.01），心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平升高（P＜0.01）。表明ECYXT中剂量组和ECYXT高剂量组的疗效优于ECYXT低剂量组。与ECYXT中剂量组比较，ECYXT高剂量组和氯沙坦钾组心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平升高（P＜0.01），其余指标差异无统计学意义（P＞0.05），说明ECYXT高剂量组调节心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白的表达能力优于ECYXT低剂量组。ECYXT高剂量组与氯沙坦钾组比较，各项指标差异无统计学意义（P＞0.05），提示ECYXT高剂量组在对以上各项指标的调节上与氯沙坦钾组具备同等效果。

Ca2+循环在心肌细胞的收缩和舒张过程中起着至关重要的作用，［Ca2+］i浓度升高会导致舒张期肌肉收缩受损和收缩期延长，与心力衰竭的病理生理密切相关。肌浆网作为储存Ca2+的细胞器，肌浆网功能紊乱导致Ca2+循环和心肌细胞功能紊乱。SERCA2a是肌浆网钙ATP酶（SERCA）在心脏中的主要表达形式，是心肌细胞［Ca2+］i浓度的主要决定因素。SERCA2a活性下降是心脏收缩不良、心肌细胞扩大进而造成心力衰竭的主要原因之一。正常情况下，兴奋-收缩耦联启动，当心肌细胞［Ca2+］i处于高浓度时，SERCA2a被激活，胞质内Ca2+被泵回内质网或通过细胞膜钠钙交换器泵出胞外，心肌细胞［Ca2+］i浓度下降，恢复静息电位。心力衰竭时，SERCA2a含量下降，不能将胞质内Ca2+泵回内质网或泵出胞外，导致心肌收缩功能下降［11］，心肌细胞［Ca2+］i浓度升高。因此，增加SERCA2a的活性成为治疗多种慢性心脏病的潜在疗法之一［12］。CaN作为一种丝/苏氨酸磷酸酶，可以通过干涉心肌细胞重构、功能重构及心肌细胞凋亡等多途径影响心力衰竭。CaN活性与心肌细胞［Ca2+］i浓度密切相关［13］，当心肌细胞［Ca2+］i浓度增加时可激活CaN，上调其mRNA及蛋白表达［14］，经过一系列反应引起心肌重构。通过抑制心肌细胞［Ca2+］i浓度进而提高CaN活性及蛋白表达、改善心力衰竭的疗效得到证实［15］。本研究结果显示，ECYXT提高了兔扩张型心肌病心力衰竭模型心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平，降低了心肌细胞［Ca2+］i浓度及心肌组织CaN mRNA及蛋白表达水平，其机制可能为ECYXT通过提高心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平，进而降低心肌细胞［Ca2+］i浓度，并基于此，下调了心肌组织CaN mRNA及蛋白表达水平。但比较ECYXT中剂量组、ECYXT高剂量组和氯沙坦钾组对心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平的变化与心肌细胞［Ca2+］i浓度和心肌组织CaN mRNA及蛋白表达水平的变化出现不一致，说明SERCA2a与心肌细胞［Ca2+］i浓度之间的调节可能并非简单的对应关系，或者与药物剂量的变化有关，其机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究通过观察ECYXT对兔扩张型心肌病心力衰竭模型进行干预，比较各组兔心肌组织形态学，血清ANP、BNP水平，LVEF、LVFS和E/A比值，心肌细胞［Ca2+］i浓度，心肌组织CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表达水平等指标发现，ECYXT能提高心功能，其机制可能是通过提高心肌组织SERCA2a mRNA及蛋白表达水平，降低心肌细胞［Ca2+］i浓度，抑制心肌组织CaN mRNA及其蛋白表达，改善心肌重构，进而改善心力衰竭。

作者贡献：李雅进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，统计学处理及结果的分析与解释，撰写论文；李玉莹进行数据收集；魏佳明进行数据整理，论文修订；郭志华负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。