基于量子点标记的降钙素原快速、高灵敏荧光免疫层析检测方法的建立及应用

廖 德 权

(广东医科大学附属医院 湛江 524000)

PCT属于抗炎物质，一般情况下其半衰期为25～30h，收集标本1d后放置于常温状态下其指标水平会下降大约12%，在体外具备一定的稳定性，蛋白酶对降钙素原有特异性降解效果，机体受到细菌感染后促使该指标分泌[1～3]。诸如新生儿肺炎、急性胰腺炎等感染性疾病中，细菌内存在的毒素刺激机体降钙素原分泌速度，在短时间内急速提升，根据该变化来作为对病情早期诊断以及临床使用药物选择有指导价值，在预后评估是如PCT指标长时间保持在高水平状态，则提示控制效果较差[4]。量子点(Quantumdots，QDs)属于新型半导体纳米材料，近年来，量子点因其具有受激发光照射发出荧光的特性而备受人们关注，目前正被大量用于分子标记技术和医学影像成像技术，同时也被视为新的理想的免疫标志物[5～6 ]。为探究基于量子点标记的降钙素原快速、高灵敏荧光免疫层析检测方法的建立及应用方法，本次研究收集我院2019年8月临床检测降钙素原标本20例，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料

收集广东医科大学附属医院2019年8月临床检测降钙素原标本20例 ，使用《WS/T 420-2012》行业标准，用量子点免疫荧光层析法和罗氏 Roche电化学发光法进行降钙素原检测，分析其诊断符合率、Kappa 一致性、ROC曲线和定量线性回归分析[7]。

1.2 方法

1.2.1精密度验证实验

实验目的：验证检测系统的重复性不精密度(Sr)、室内不精密度(S1)。实验方法：使用《WS/T 420-2012》行业标准，选择室内质控品(高值、低值)各1份，每个水平重复测定3次，连续5天。离群值检验：单次测量值超过总均值±4SD；数据剔除量：小于总测量数据量的5%；评价标准：重复性不精密度≤1/4TEa；室内不精密度≤1/3TEa或小于验证值。或按照中华人民共和国卫生行业标准WS/T 403-2012≤临床生物化学检验常规项目分析质量指标》对精密度的要求进行。

1.2.2验证实验室内检测系统的检验结果一致性

实验方法：使用《WS/T 420-2012》行业标准，选取参加室间质评的系统作为比对方法，用实验方法、比对方法分别检测最少20份血清标本，标本浓度在线性范围内均匀分布，每个标本测定1次，1天4h内完成。评价标准：偏倚图中不同浓度处偏倚分布均匀；若不均匀则分段处理Bias按照中国卫生部临床检验中心室间质评要求小于1/2TEa，或按照中华人民共和国卫生行业标准WS/T 403-2012《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》对正确度的要求进行[8～9]。实验方法：深圳金准量子点免疫荧光层析法；比对方法：罗氏 Roche 电化学发光法；实验仪器：深圳金准；比对仪器：cobas e601。

1.2.3所有样本均无反复冻融

每一例标本均用量子点免疫荧光层析法和电化学发光法进行降钙素原检测，并将所有样本的量子点免疫荧光层析法降钙素原检测结果作为试验组，相应的将电化学发光法检测所有标本的降钙素原浓度结果作为对照组[10～11]。

1.3 统计学方法

应用Excel对本次研究的数据进行收集，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度验证实验结果

水平1实验不精密度大于允许不精密度，检测系统精密度不可接受，水平2实验不精密度小于允许不精密度，检测系统精密度可以接受，水平1、水平2实验数据见表1～4。

表1 精密度验证试验结果(水平1)

批间方差=0.001

室内标准差=0.040

总均值=0.316

表2 实验室允许不精密度、实验不精密度结果对照表(水平1)

表3 精密度验证试验结果(水平2)

表4 实验室允许不精密度、实验不精密度结果对照表(水平2)

2.2 验证实验室内检测系统的检验结果一致性

实验室内检测系统的检验结果一致性结果表明，检测系统可比性验证通过,回归方程为:y=1.0472x+0.2444，R2=0.999。

表5 验证实验室内检测系统的检验结果一致性

两方法间绝对偏倚=-0.11

两方法间相对偏倚=-4.03%

绝对偏倚标准差=0.394

相对偏倚标准差=13.99%

图1 偏移图(绝对偏倚)

图2 偏移图(相对偏倚)

图3 线性回归图

2.3 不同 cut-off 值下量子点免疫荧光层析法诊断效能评价

以罗氏公司电化学发光法作为标准，对分析量子点免疫荧光层析法的诊断效能进行比较，当PCT浓度为0.5ng/ml时，2种方法间诊断符合率达97.87%；当PCT浓度为2.0ng/ml时，2种方法间诊断符合率达98.44%。

3 讨论

PCT水平增高通常发生在感染后2h，其表达水平高低能反映全身炎症反应及感染的活跃程度[12 ]。PCT是血清降钙素(CT)前肽物质，由116个氨基酸组成糖蛋白质，正常生理下，由甲状腺C细胞分泌产生。健康人群血清PCT水平很低，低于0.05ng/ml，在创伤、炎性反应刺激尤其是细菌感染或脓毒症状态下，机体各组织、多种细胞类型均可产生PCT并释放进入血液循环系统。验证实验室内检测系统的检验结果一致性结果表明，检测系统可比性验证通过,回归方程为:y=1.0626x+0.0044，R2=0.9913。当PCT浓度为0.5ng/ml时，两种方法间诊断符合率达97.87%；当PCT浓度为2.0ng/ml时，量子点免疫荧光层析法与电化学发光法两种方法间诊断符合率达98.44%。Cut-off值为0.5ng/ml和2.0ng/ml时，两者ROC曲线下面积分别为0.964和0.985，均表明两种检测方法无显著差异(P>0.05)。综上所述，在检测系统上的精密度验证实验基本符合实验室要求，检测系统检验结果可比性符合要求。量子点免疫荧光层析法和电化学发光法之间具有诊断一致性和相关性。