OCA2 基因核苷酸rs4778137多态性对三阴性乳腺癌新辅助化疗效果的影响研究

雷浩 杨文荣 李仲华

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一种孕激素受体(progesterone，PR)、雌激素受体(estrogen，ER)、人表皮生长因子受体2(human epithelial growth factor receptor-2,HER-2)均表达较少或无表达的疾病，具有较高的异质性、较强的侵袭能力并易向远处转移，且治疗方法有限、存活率较低、预后较差[1-3]。目前乳腺癌发病率约占所有恶性肿瘤的23%，且世界以每年130万增量不断增多，死亡率较高，而TNBC病人占乳腺癌病人的比例为15%～20%[4-5]。化疗是TNBC较常见的治疗方法，但有些病人对于常规化疗无反应或者恶心。目前应用较广泛的治疗方法大都集中于新辅助化疗，其不但能清除微小转移灶提高保乳率、降低耐药性，而且能降低肿瘤分期甚至能提高病理完全缓解(pathologic complete response，pCR)病人的远期生存[6-7]。但因基因不同导致个体差异较大，新辅助化疗效果也不尽相同。基因OCA2又名酪氨酸酶基因，和酪氨酸代谢有关，在白化病治疗中被广泛研究[7]。此外，OCA2对于恶性肿瘤的发生、发展意义重大，OCA2的变异能引起乳腺癌病人治疗效果的差异。本研究通过对基因OCA2的核苷酸序列rs4778137多态性的研究，探讨其与新辅助化疗效果的相关性。

对象与方法

一、对象

经本院伦理委员会同意，选取2016年2月～2020年3月在本院确诊为TNBC女性病人72例为研究对象，年龄33～74岁，平均年龄(48.6±5.7)岁，绝经32例，未绝经40例，淋巴结转移37例，病程6天～3年，平均病程(1.9±0.8)年，体质量指数(23.6±2.0)kg/m2。TNBC病人pCR标准为治疗后病理结果显示乳房及腋窝处均不存在癌残留。

纳入标准：(1)病理结果显示ER、PR、HER-2均为阴性的乳腺浸润性导管癌病人，且TNM分期为Ⅱb～Ⅲc期的局部晚期乳腺癌；(2)临床病理学资料完整；(3)无其他肿瘤病史；(4)年龄20～80岁；(5)病人及家属自愿参与研究，并签署知情同意书。排除标准：(1)患有重大心、肺、肾疾病；(2)入组前1个月服用过治疗乳腺癌的药物；(3)患有精神疾病；(4)中途退出研究；(5)炎性乳腺癌、鳞癌病人、男性乳腺癌；(6)对新辅助化疗过程使用药物过敏或不愿接受新辅助化疗。

二、方法

1.新辅助化疗方法：采用环磷酰胺(国药准字H32024654，江苏盛迪医药有限公司)联合盐酸表柔比星[国药准字H20000496，辉瑞制药(无锡)有限公司，规格：10mg/瓶]续贯紫杉醇(国药准字H20064299，扬州奥赛康药业有限公司,规格：16.7ml ·100 mg/瓶)方法：用5%的葡萄糖溶液10 ml稀释紫杉醇至175 mg/m2，并使用振荡器(货号：Vortex 3000，北京乾明基因技术有限公司)震荡10分钟，待其溶解后转移至500 ml的葡萄糖溶液中，静脉注射3小时；环磷酰胺注射液静脉注射按体表面积每次500 mg/m2，加生理盐水20～30 ml，盐酸表柔比星10 ml,溶解为65 mg/m2，缓慢注射，1周期20天，连续治疗6～8周期后接受手术治疗[8]。

2.检测方法：(1)DNA序列检测方法。试管中提前加入血液抗凝剂(货号：CD-02843-ML，武汉纯度生物科技有限公司)，早晨抽取受试者空腹状态下静脉血10 ml，用DNA提取检测试剂盒(货号：FG0310-T，江苏凡知医疗科技有限公司)提取，严格按照试剂盒使用说明操作，同时设计扩增rs4778137的引物，进行PCR扩增。PCR扩增方法：95 ℃预变性15分钟，95 ℃变性10分钟,55 ℃退火30 s，75 ℃延伸5分钟。最后对扩增PCR扩增产物进行基因型检测。(2)生化指标检测方法。使用全自动生化分析仪(型号：Selectra E Chemistry Analyzer，上海玉研科学仪器有限公司)检测手术前病人甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TCH)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、尿素氮(blood urea nitrogen，BuN)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDLP)、尿酸(uric acid，UA)、白蛋白(albumin，ALB)水平。

三、统计学方法

结果

1.病人病理资料、生化指标与pCR相关性比较：术后32例达pCR，pCR和非pCR病人年龄、N分期、月经状态比较，差异无统计学意义(P>0.05)。病程在2年以上的病人，pCR病人比率(26.3%)小于病程低于2年的病人比率(67.6%)，差异有统计学意义(P<0.05)。病人T1和T2期pCR病人比率(53.3%、56.5%)高于T3和T4期(36.4%、25.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。无淋巴结转移病人，pCR病人比率(60.0%)高于淋巴转移病人(18.9%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 TNBC病人基本资料与pCR相关性(例,%)

术后pCR和非pCR病人TG、TCH、TBIL、FBG、BUN、HDLP比较，差异无统计学意义(P>0.05)，UA和ALB比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 生化指标与pCR相关性

2.OCA2 rs4778137多态性和pCR的相关性：rs4778137位点上CC、GC、GG基因型频率分别为20.8%、29.2%、50.0%，pCR病人GG基因型频(52.8%)高于非pCR(47.2%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 OCA2 rs4778137多态性和pCR相关性(例，%)

3.TNBC病人pCR率影响因素的Logistic回归分析：TNBC病人病程不是pCR率的独立影响因素(P>0.05)。而T分期、淋巴转移、rs4778137多态性、UA、ALB是TNBC病人pCR率的独立影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 不同因素对TNBC病人pCR率的Logistic回归分析

讨论

随着生活节奏加快，乳腺癌已成为我国较常见的恶性肿瘤疾病之一，且每年增速达4%[9]。TNBC是乳腺癌的一种，其发病机制尚不明确，可能与家族史、生殖因素、性激素、营养与饮食、环境、乳腺癌相关基因等有关[10-11]。

基因核苷酸多态性可致使肿瘤产生多种生物学表现[10-12]。基因OCA2 是人体内一种包含内含子总长度约为345kb的基因片段，在恶性肿瘤中发挥重要作用。有研究表明，基因OCA2的遗传和变异能影响乳腺癌的发生及病情进展[13]，对于乳腺癌的预后有重大意义。此外，基因OCA2核苷酸多态性还与皮肤癌以及器官移植后皮肤鳞状细胞癌发生有关，OCA2基因rs1800407位点多态性亦能造成皮肤黑色素瘤[13]。早在1982年，乳腺癌开始新辅助化疗，目前新辅助化疗已经被广泛应用到乳腺癌的治疗中。

本研究中，pCR率为44.4%，稍高于既往研究[13]，可能与病例数少有关，郭俊强等[13]研究证实，TNBC新辅助化疗的pCR率高于其他类型乳腺癌，为35.7%。本研究显示，pCR和非pCR病人年龄、N分期、月经状态差异不显著，说明TNBC病人年龄、N分期、月经状态对pCR率影响不大。TNBC病人病程越长pCR率越低，可能是因为患病时间较长，肿瘤在体内转移较多，导致机体防御系统抵抗能力降低，使pCR率较差，说明及时发现并及时治疗意义重大。TNBC病人T1和T2期pCR病人比率比T3和T4期高(P<0.05)，并随着分期推进pCR病人比率不断降低，说明T分期可能通过一定机制影响机体pCR病人比率，能通过T分期间接反映病人发病程度。TNBC病人pCR病人比率与淋巴结转移有关[14]，淋巴结转移说明癌症处于扩散状态，侵袭机体防御系统，导致人体免疫能力降低，进而pCR病人比率下降。此外，术后pCR和非pCR病人TG、TCH、TBIL、FBG、BUN、HDLP水平差异不显著(P>0.05)，而UA和ALB有明显差异(P<0.05)。TNBC会引起机体免疫系统作用，进而影响机体内炎症指标及生化指标，本结果显示结果不一致，可能是样本量较少或受试者生活环境及饮食不同导致的。本研究结果显示，pCR病人GG基因型频显著高于非pCR，病人OCA2基因rs4778137多态性影响TNBC病人pCR率(P<0.05)，说明OCA2基因rs4778137遗传和变异可能参与调控TNBC病人缓解过程。Logistic回归分析显示，TNBC病人病程不是pCR率的独立影响因素(P>0.05)，而T分期、淋巴结转移、rs4778137多态性、UA、ALB是TNBC病人pCR率的危险因素，应该从以上几方面对病人进行保护和预防。

综上所述，rs4778137多态性和TNBC病人新辅助化疗pCR率有关，GG基因型病人有较高的pCR率。病程在2年以上、处于T3和T4期、存在淋巴结转移病人的pCR率较低。T分期、淋巴转移、OCA2基因rs4778137多态性是TNBC病人pCR率的独立影响因素。