甜菜BTB蛋白家族的挖掘与生物信息学分析

刘宇，杨巧，王晓丹，赵春雷，王希，李彦丽，贾海伦，丁广洲，陈丽

（1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2.黑龙江省甜菜工程技术研究中心，哈尔滨 150080；3.国家糖料改良中心，哈尔滨 150080；4.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨 150080；5.国家甜菜种质中期库，哈尔滨 150080）

0 引言

世界糖产量每年约1.6亿t，其中甜菜糖占20%左右，人均食糖消费量约为23 kg，由于中国和印度等人口稠密国家生活水平的提高，每年用糖的需求量在不断增加。尽管甜菜是耐旱作物，但甜菜的生产区域正面向盐碱、干旱、冷凉地区扩展[1]，面临着严重不利外界条件的影响，各种生物胁迫和非生物胁迫都会使甜菜减产。所以，挖掘甜菜的抗性基因非常重要，可以为甜菜的抗性育种提供理论依据。

植物基因组中有许多转录因子家族，它们一般通过结合靶基因的启动子激活或抑制其表达，在调节植物生长发育中发挥着重要的作用[2-3]。BTB（Broad-complex,tramtrack,and bric-à-brac）家族就是这样的一类转录因子，其特征是存在高度保守的BTB结构域，也被称为POZ（痘病毒锌指蛋白）结构域[4-5]。BTB蛋白一般由5 个α-螺旋（A1～A5）和3 个β-折叠（B1～B3）组成[6]，这有利于BTB 蛋白与其它蛋白进行互作，如BTB 蛋白能够与E3 连接酶CULLIN3 相互作用，形成E3 泛素连接酶复合物的一部分参与目标蛋白的泛素化过程[7]。BTB蛋白家族除了包含BTB蛋白结构域外，还存在其他几种蛋白结构域，如锌指蛋白（TAZ）、Kelch、BTB和C端Kelch（BACK）、meprin and TRAFhomology（MATH）以及Ankyrin repeats（ANK），从而使BTB蛋白形成了不同亚家族，并发挥着不同的作用[4-5]。在这些亚家族中，BT-TAZ（BT）蛋白只存在于植物中，它的N 端是BTB 结构域，中心是TAZ结构域，C端是钙调素结合域（CaMBD）[8-9]。

BTB蛋白在植物生长发育、抗逆性、蛋白质泛素化和降解、细胞骨架组成、离子通道及细胞周期调控等方面发挥着重要作用[10-11]。现有的研究表明，含有BTB蛋白的ATETO1、ATEOL1和ATEOL2蛋白可以调节乙烯的合成[12]；含有BTB 的BT2 可以介导多种营养物质，并对胁迫和激素做出反应；含有ANK 和BTB 的ATBOP1蛋白，在植物的形态建成中起着关键的作用[13]。根据已有的研究发现，拟南芥NPR1（非表达的发病机制的相关基因1）蛋白含有BTB 结构域，是诱导性系统抗性（ISR）和系统获得性抗性（SAR）信号通路的关键调节因子。植物中许多BTB蛋白家族成员参与了激素介导的植物相关信号的调控，如水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）[14]。AHT1（ABA-HYPERSENSITIVE BTB/POZ PROTE IN1）是一种含有BTB 的蛋白，对ABA 介导的抑制拟南芥萌发具有负调控作用[15]。另据报道，拟南芥中6 种BTB/POZ-MATH 蛋白（BPMS）参与ABA 反应，如调节萌发和气孔关闭[16]。ATHB6（Homeobox-leucine zipper 转录因子）能负调控ABA 并参与BPMS 的泛素化和降解[15]。近年来，在许多植物物种中发现了BTB 家族成员，包括拟南芥[8]、水稻[17]、番茄[5]和苹果[18-19]，但是关于甜菜BTB 家族的报道很少。然而，只有少数BTB 蛋白在功能上得到了验证。本研究中，针对甜菜基因组对甜菜的BTB 家族进行挖掘，然后对甜菜的BTB 蛋白家族进行生物信息学分析，为后续研究其在甜菜的抗逆分子生物学机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 甜菜BTB家族基因的挖掘和蛋白的理化性质分析

利用SMART 数据库（http://smart.embl-heidelberg.de/）获得甜菜中所有包含BTB 结构域的蛋白；并通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Pfam 数据库（http://pfam.sanger.ac.uk/）加以验证，最终筛选出甜菜的BTB 蛋白家族，并获得甜菜BTB 蛋白家族的基因序列和蛋白序列。利用拟南芥基因组数据库（TAIR，https://www.arabidopsis.org/），获得拟南芥BTB 基因序列和蛋白序列[20]。使用在线软件pI/Mw（http://web.expasy.org/protparam/）对所获得的49个甜菜BTB家族蛋白的理化性质进行分析。

1.2 甜菜BTB家族基因的结构分析

在Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）下载已鉴定的甜菜BTB 家族的DNA 序列和CDS 序列，用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）制作基因结构图[21]。

1.3 甜菜BTB蛋白的二级结构和三级结构预测

将获得的甜菜BTB 蛋白家族的蛋白序列利用SMART、NCBI Conserved Domain search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、Pfam（http://pfam.xfam.org/search）分析，最后利用TBtools预测的甜菜BTB蛋白家族的结构域，利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）预测蛋白的三级结构。

1.4 甜菜BTB家族基因的染色体定位分析

在Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）获得基因的位置信息，通过MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）获得甜菜BTB家族基因的染色体定位图。

1.5 甜菜BTB蛋白的系统发育分析

利用Clustal Omega program（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对甜菜49 个BTB蛋白（BVRBs）及拟南芥80 个BTB蛋白（AtBTBs）进行多序列比对分析后，利用evolview（https://evolgenius.info/evolview-v2/#login）构建系统发育树，重复次数为1 000 次[22]，并结合Evolview 构建的甜菜与拟南芥系统发育树最终确定蛋白结构域并对其进行分类。

2 结果与分析

2.1 甜菜BTB蛋白的系统发育分析

对甜菜49 个BTB 蛋白（BVRBs）和拟南芥80 个BTB 蛋白（AtBTBs）的氨基酸序列进行多序列比对及系统发育树分析发现，根据文献报道的拟南芥BTB 蛋白亚家族的分类，甜菜BTB 蛋白被分为9 个亚家族[19-20]：Ankyrin、Armadillo、MATH、NPH3、BACK、TAZ、TPR、BTB-only、Other，在同一亚家族中，甜菜和拟南芥BTB 蛋白的数量差异较大。其中NPH3 亚家族的数量最多，包含16 个甜菜BTB 家族基因，30 个拟南芥BTB 家族基因；TPR亚家族的数量最少，只包含1个甜菜BTB家族基因，3个拟南芥BTB家族基因（图1）。

图1 甜菜与拟南芥BTB家族的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of BTB family in Beta vulgaris L.and Arabidopsis thaliana

2.2 甜菜BTB蛋白的理化性质分析

由表1可以看出49个蛋白编码的氨基酸数目为139～1 120个，其中BVRB_007930包含的氨基酸数目最多，为1 120 个，BVRB_3g058930 最少，只有139 个；49 个蛋白的等电点范围在4.70～9.51，除了TAZ 亚家族与NPH3 亚家族部分的蛋白，其他家族等电点都分布在4.70～7.89，说明甜菜BTB 家族编码的氨基酸大多数都为酸性氨基酸；除BVRB_7g159950、BVRB_05090外，其他蛋白的平均亲疏水性都为负值，说明甜菜BTB蛋白家族大部分属于亲水性蛋白；49个BTB蛋白的磷酸化位点数目分布在3～25个，不同蛋白磷酸化位点数目差异很大，从3种磷酸化位点的数目上看，丝氨酸磷酸化位点数目最多，苏氨酸磷酸化位点次之，酪氨酸最少；亚细胞定位预测的结果显示，甜菜BTB 家族的大部分蛋白位于细胞核（36 个），剩余的蛋白分别位于细胞膜和叶绿体上；49 个蛋白的分子量为15 848.66～124 344.33 Da，除少数蛋白分子量过大或过小，大部分蛋白分子量范围在50 000～80 000 Da。

表1 甜菜BTB 蛋白家族的理化性质分析Table 1 Physical and chemical properties of BTB protein family in sugar beet

续表1 Continued Table 1

2.3 甜菜BTB家族基因结构分析

甜菜BTB家族不同亚族的基因结构存在较大的差异，比如Other亚家族的基因结构较简单，大部分成员都不含内含子；Armadillo 亚家族的内含子数量最多，含有18 个内含子；BACK 亚家族的内含子长度较长（图2）。

图2 甜菜BTB蛋白家族的基因结构Fig.2 The genetic structure of BTB protein family genes in sugar beet

2.4 甜菜BTB蛋白的二级结构与三级结构分析

结构域预测的结果显示，甜菜BTB蛋白家族大多数含有2～3个结构域（图3），不同的结构域可以行使不同的功能，说明甜菜BTB蛋白家族的功能具有多样性。三级结构预测的结果显示，甜菜BTB蛋白家族以α螺旋和β折叠为主（图4），但不同亚家族的结构域数量存在着差异，这也是不同亚家族功能差异的原因之一。

图3 甜菜BTB蛋白家族的结构域分析Fig.3 Domain analysis of BTB protein family in sugar beet

图4 甜菜BTB亚家族蛋白的三级结构预测Fig.4 Prediction of tertiary structure of sugar beet BTB subfamily protein

2.5 甜菜BTB家族基因染色体定位分析

由甜菜49个BTB基因的染色体定位（图5）可看出，甜菜BTB家族成员呈不均匀分布，其成员主要分布在5、6、7号染色体上，而1、3、8号染色体上分布的基因最少，只含有2个BTB成员。进一步分析发现，在5号和6号染色体上的BTB家族成员呈区域性分布，主要集中在染色体上的某段区域。

图5 甜菜BTB蛋白家族基因的染色体定位Fig.5 The chromosome location of BTB protein family genes in sugar beet

3 讨论与结论

目前在玉米中鉴定出BTB 家族蛋白70 条[23]，拟南芥中鉴定出80 个BTB 蛋白，水稻中鉴定出149 个BTB蛋白[6,17]，说明不同物种间BTB 蛋白数量存在较大差异。本研究从SMART 数据库中共筛选到49 条完整的甜菜BTB 家族蛋白，并通过相关生物信息学工具对其进行了生物信息学分析。本研究结果表明：（1）将甜菜BTB的家族蛋白和拟南芥BTB的家族蛋白通过聚类分析法构建了系统进化树，由于BTB家族的保守性，具有相似或者相同功能的基因位于同一组，可以分为Ankyrin、Armadillo、MATH、NPH3、BACK、TAZ、TPR、BTBonly、Other亚家族，同时也说明BTB 家族在进化上一直趋于保守，我们可以利用BTB家族的保守性来推测甜菜BTB 家族的功能。（2）不同亚族蛋白的染色体结构、结构域都存在着差异，染色体结构与基因的表达有关，结构域与蛋白的功能行使有关，推测各个亚族的功能有所不同。对49 个蛋白的理化性质分析结果表明，不同组别蛋白在编码氨基酸数目、平均等电点等方面存在差异，这也可能决定了不同组别蛋白执行不同生物学功能。（3）蛋白的磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的重要机制，在细胞信号转导过程中起着重要作用，有相关报道表明一些蛋白及其它转录因子蛋白可以通过磷酸化提高植物的抗逆能力[24]。本研究中49 个蛋白含有3～25 个磷酸化位点，说明每个BTB 蛋白的部分或全部磷酸化位点都有可能被特定的蛋白激酶磷酸化，从而响应外界的各种生物和非生物胁迫。（4）对49个甜菜BTB 蛋白的亚细胞定位预测结果表明，其中的36 个定位于细胞核上，其余的分别定位于叶绿体、细胞膜中，说明大多数蛋白都是在细胞核中对下游基因进行转录调控，以适应外界的环境变化，而定位在其它部位的蛋白则需通过进一步试验来确定其功能。（5）染色体定位结果表明，甜菜BTB家族在甜菜的所有染色体上都存在，主要集中在5～7号染色体上，说明BTB家族广泛参与甜菜的生理活动，是维持甜菜正常生命活动必不可少的蛋白家族。

近年来，有越来越多关于BTB蛋白参与植物应激反应的报道[2,25]，但甜菜BTB家族的报道很少，所以对甜菜BTB家族的研究还有很大的前景。BTB蛋白对植物的发育和抗逆性起着重要的作用，比如，BTB成员在配子体的发育[9]、激素和糖信号传导[26]、叶衰老[27]、防御反应[28-29]和非生物应激反应[2]，包括铁稳态在内的营养[16]和硝酸盐吸收中[25,30]都起着至关重要的作用。而且越高等的植物所含的BTB 蛋白越多，比如BTB 蛋白广泛存在于高等开花植物和低等单细胞植物中，相反，单细胞藻类，特别是细小微胞藻（Micromonas pusilla）和绿色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus），只能编码较少的BTB 蛋白[31]。本文通过对甜菜BTB 家族的生物信息学分析，可为甜菜BTB 家族在冷、盐、干旱胁迫与生长发育，以及生物胁迫反应中的功能及表达研究奠定基础，下一步可先观察BTB家族与甜菜的哪些抗性生理有关，然后对甜菜BTB家族进行克隆及功能验证。