高效液相色谱－蒸发光散射法测定液态乳中乳果糖含量

孙 佩，任 硕，陈柔含，古淑青*，钮 冰，邓晓军

（1.上海大学 生命科学学院 食品工程系，上海 200436；2.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；3.上海市农产品质量安全中心，上海 201708）

乳果糖，又名4-Ο-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，是液态乳热加工过程中，乳糖在酪蛋白游离氨基的催化下碱基异构化形成的一种双糖［1］。乳果糖在生牛乳中含量甚微，不同的加热处理方式产生的乳果糖含量不同。因此，乳果糖可作为判断液态奶热加工方式的重要指标［2］。国际乳品联合会（IDF）建议乳果糖作为区分巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳（UHT milk）的指标，并规定其在UHT乳中的含量为100～600mg/L［3－4］。

目前乳果糖测定方法以酶催化法［5］、酶解－分光光度法［6－7］、离子色谱法［8－9］、气相色谱法［10－11］和液相色谱法［4，7，12−13］为主。我国农业部颁布的NY/T939－2016标准采用多步酶解反应，紫外分光光度计检测乳果糖［6］，但该方法需用6种酶，任何一种酶失活都将导致实验失败，且操作繁琐耗时［7］。在离子交换色谱中，乳果糖和色谱柱离子成分之间通过进行离子交换而保留，因此控制目标样品在碱性/酸性溶液中呈现离子化状态是关键［14］。但糖类物质在电极表面易与某些分子发生氧化还原反应，进而影响方法的准确性［15］。气相色谱法灵敏度高，却难以实现乳果糖与液态乳中其他二糖的分离［16］。Liu等［17］建立了液态乳中乳果糖的液相色谱串联质谱测定方法，该方法灵敏度高，但质谱仪器昂贵，成本较高，且需先进行酶解以排除麦芽糖的干扰。

高效液相色谱法能同时检测多种糖分，具有检测效率高、灵敏度好、操作简便等特点，其检测器主要有示差折光检测器（RID）和蒸发光散射检测器（ELSD）［18］两种。相对于RID，ELSD更稳定，且分离糖类化合物效果好［19］。Schmidt等［20］开发了一种定量复杂糖溶液中乳果糖的HPLC−ELSD，能排除结构相似或分子量相同的糖类干扰，但该方法只适用于酶法生产的乳果糖样品。李盛楠等［21］使用改性酰胺柱对灭菌乳中的乳果糖进行分离，但为避免乳中其他二糖与酰胺柱上的活性基团结合对色谱峰产生干扰，需在前处理过程中加入酶解步骤，增加了前处理过程的复杂度。Schuster－Wolff－Bühring等［19］发现氨基柱能更好地分离乳果糖、乳糖，但目前所报道的基于氨基色谱柱的乳果糖检测均需要较长时间的梯度洗脱［18－20］。因此，虽然目前已有文献报道乳果糖的HPLC－ELSD测定方法，但均存在基质不适用，前处理复杂或检测时间长等不同程度的问题。基于此，本研究在前人研究的基础上建立了液态乳中乳果糖含量测定的HPLC－ELSD，并优化了样品前处理条件及仪器参数。该方法操作简便、重复性好，可满足液态乳中乳果糖含量的测定。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

乙腈、冰醋酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；醋酸铵（美国Sigma公司）；乳果糖、乳糖标准品（纯度≥95%，中国食品药品检定研究院）。

进口液态乳样品为法定入境检验检疫样品，国产液态乳样品包括无乳糖舒化奶购于当地超市。

1.2 仪器与设备

1260InfinityⅡ液相色谱（Agilent公司，USA），配蒸发光散射检测器（ELSD）；Allegra X－22R离心机（Beckman Coulter公司，美国）；高速涡旋震荡器（Eyela公司，日本）；实验用水由Milli-Q超纯水系统（Millipore公司，美国）制得。

1.3 标准溶液的配制

准确称取0.1 g乳果糖标准品，用水溶解定容至10mL，配成10mg/mL的乳果糖标准储备液。准确吸取乳果糖标准储备液1mL至10mL容量瓶中，用85%（体积分数）乙腈水溶液定容至刻度，配成质量浓度为1mg/mL的标准工作液，现用现配。

为考察乳糖与乳果糖的分离效果，配制乳果糖含量为10mg/mL，乳糖含量为120mg/mL的乳果糖－乳糖混合标准储备液，使用时用85%（体积分数）乙腈水溶液稀释至所需浓度。

1.4 实验方法

1.4.1 样品前处理 取1mL液态乳，加入1mL0.4 mol/L醋酸铵溶液（pH3.8 ），用水定容至5mL，涡旋混匀3min，以4000r/min离心5min。上清液经0.22 µm水相膜过滤后，取100µL滤液用85%乙腈水定容至1mL，过0.22 µm有机膜，供色谱分析。

1.4.2 色谱条件色谱柱：氨基柱（Exsil100HAAX，150mm×2mm，3µm，Extreme公司，美国）；流动相：乙腈－水（85∶15，体积比），流速0.8 mL/min；洗脱时间8min；柱温箱温度35℃；进样体积10µL。

蒸发光散射检测器条件：雾化气温度60℃，蒸发气温度70℃，载气流速1.4 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的确定

液态奶中含有大量蛋白和脂肪，未经前处理直接进样会堵塞仪器管路和色谱柱，常用的蛋白质沉淀方法有机溶剂沉淀法和pH值调节法［13］。本实验分别考察了95%乙醇、95%乙腈和0.4 mol/L醋酸铵（pH3.8）沉淀蛋白的效果。结果显示：采用95%乙醇、95%乙腈沉淀蛋白后的样品仍存在大量干扰组分（图1A、B），无法在氨基柱上实现乳果糖与乳糖的分离检测，而经0.4 mol/L醋酸铵溶液（pH3.8 ）处理后的样品溶液，不仅蛋白质充分沉淀，干扰峰得以去除，乳果糖和乳糖也得以较好地分离（见图1C）。

图1 不同蛋白沉淀方法的色谱图Fig.1 Chromatograms of different protein precipitation methods

2.2 ELSD条件的优化

一般情况下，载气流速越小，形成的颗粒半径越大，对激光的散射能力也就越强，相应的响应信号越大。但流速过小会导致流动相不能被完全挥发，背景噪音增加，信噪比下降［22］。最优的载气流速应在可接受噪音的基础上产生最大响应值。因此实验在雾化气温度70℃，蒸发气温度60℃条件下，考察了不同载气流速（1.2 、1.4 、1.6 、1.8 mL/min）对信号响应的影响（图2A）。结果显示：随着载气流速增大，待测物的峰面积逐渐减小，但信噪比呈先增加后减小的趋势，当载气流速为1.4 mL/min时达到最优。实验选择1.4 mL/min为最佳载气流速。

图2 不同载气流速（A）、雾化气温度（B）和蒸发气温度（C）时乳果糖的色谱图Fig.2 Chromatograms of ractulose under different gas flow rates（A），nebulous temperatures（B）and evaporative temperatures（C）

雾化气温度、蒸发气温度也是影响检测灵敏度的重要因素。雾化气温度越高，待测组分雾化越充分，响应值越高，但雾化气温度过高会使待测组分过度分散而导致响应变低。蒸发气温度越高，溶剂挥发越充分，样品颗粒经散射后噪声降低，响应值越高，但蒸发气温度过高会导致待测组分分解而响应降低。因此，固定载气流速不变，分别考察了雾化器温度、蒸发气温度对检测信号的影响。结果发现，雾化气温度为70℃，蒸发气温度为60℃时，乳果糖的响应最高（图2B、C）。

2.3 线性关系、检出限及定量下限

按“1.3 ”方法配制质量浓度分别1.0 、2.0 、5.0 、10、20、50、100mg/L的乳果糖标准溶液，在优化条件下，以乳果糖质量浓度的对数值（x）为横坐标，响应峰面积的对数值（y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示：乳果糖标准溶液在1.0 ～100mg/L质量浓度范围内呈线性关系，线性方程为y=1.299 x+0.1176 ，相关系数（r2）为0.9980 。

以无乳糖舒化奶为空白基质，通过基质加标确定方法的检出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），该方法LOD为15mg/L，LOQ为50mg/L。

2.4 回收率与相对标准偏差

在优化条件下，分别考察了乳果糖在巴氏灭菌乳以及超高温灭菌乳中的回收率。采用质谱法［17］测得巴氏杀菌乳中乳果糖的本底平均值为4.6 mg/L，超高温灭菌乳中乳果糖的本底平均值为383mg/L；根据不同基质中乳果糖的本底含量差异，设置巴氏灭菌乳中3个加标水平分别为50、100、500mg/L，超高温灭菌乳中3个水平分别为200、400、800mg/L，每个水平平行测定6次，得乳果糖在巴氏灭菌乳以及超高温灭菌乳中的回收率为85.1%～110%，相对标准偏差（RSD）不高于7.5 %（表1）。

表1 乳果糖的回收率及相对标准偏差（n=6）Table1 Spike recoveries and RSDs of lactulose（n=6）

2.5 实际样品的检测

采用本方法检测20个国内外超高温瞬时灭菌乳中的乳果糖含量。结果显示：超高温瞬时灭菌乳的乳果糖含量为350～751mg/L（表2），不同样本间乳果糖含量差异较大。根据国家农业行业标准NY/T939－2016规定（超高温瞬时灭菌乳中乳果糖含量不应超过600mg/L），大部分市售超高温瞬时灭菌乳均在限定范围内，仅1个样品超出规定范围，表明存在液态奶循环处理或热处理过程中温度过高的可能，典型样品的乳果糖色谱图见图3。

表2 实际样品中乳果糖的测定结果Table2 Determination result of lactulose in real samples

3 结 论

液态乳中的乳糖含量远高于乳果糖，普通方法难以将二者分离，增加了乳果糖定量的难度。本研究采用醋酸铵沉降蛋白，氨基柱分离，建立了HPLC－ELSD测定液态乳中乳果糖含量的分析方法。方法前处理快速简便，色谱柱适用性强，稳定性好，在优化条件下，该方法可长时间内保持良好的分离效果和较高的灵敏度。整个液相检测仅需8min，与现有方法约需30min相比，检测效率大大提高，可用作液态乳中乳果糖的日常检测。