胶质细胞源性神经营养因子在脊髓损伤中的相关作用研究

刘书画，李 艺，胡小莉，卢 枫，康艳敏，王雄伟，彭观发，叶军明

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院第一附属医院麻醉科；3.赣南医学院2017级硕士研究生；4.赣南医学院2018级硕士研究生；5.赣南医学院2020级硕士研究生；6.赣南医学院，江西 赣州 341000）

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是中枢神经系统最严重创伤之一，严重影响患者的日常生活并给家庭和社会带来沉重负担。而近年来随着交通、意外等事故频发，SCI的发病率升高并呈年轻化。目前多采用激素、药物、手术及康复等治疗方法，但都很难取得较为满意的效果。SCI是由直接或间接因素引起脊髓神经元损伤或死亡、轴突断裂、局部BSCB及血管系统破坏等原发性损伤，随后出现包括脊髓水肿、促炎因子释放、NO和氧自由基产生、胶质细胞激活、胶质瘢痕形成等一系列继发性损伤。两种损伤的作用导致神经细胞死亡，而脊髓内环境的恶化使得神经元再生修复很难完成。所以有效的抑制神经炎症的发生发展、胶质瘢痕形成，积极促进神经元存活修复及轴突再生是治疗SCI的重点。

胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）是神经系统早期发育所必需的营养因子，GDNF缺乏可引起神经系统发育异常。神经元（包括发育中和成熟的神经元）、胶质细胞和施万细胞均可表达GDNF，其中胶质细胞表达的GDNF约占其总量的6%［1］。GDNF能够促进感觉、运动、交感神经、副交感神经、多巴胺能神经元及胶质细胞等多种神经细胞的存活，促进突触和髓鞘形成［2］。脊髓损伤后GDNF可经受损轴突逆行运输到损伤神经元，发挥直接的神经营养作用，抑制受损神经元死亡，同时增加再生轴突的数目、直径及髓鞘的数量，加快轴突再生。GDNF可降低脊髓损伤引起的血脑脊髓屏障（Blood-spinal cord barrier，BSCB）高通透性，减轻受损脊髓的水肿，为SCI修复提供良好的微环境。

1 GDNF与相关受体

胶质细胞源性神经营养因子家族配体（Glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands，GFLs）有7个间距相似的保守半胱氨酸残基，是TGF-β超家族的远亲成员。GFLs有4个成员：GDNF、neuturin（NRTN）、artemin（ARTN）、persephin（PSPN），在促进神经修复方面GDNF的作用最强。GFLs受体 主 要 有：GFRα1-4（GDNF-GFRα1、NRTN-GFRα2、ARTN-GFRα3、PSPN-GFRα4）。RET是GFLs的共受体，一般情况下GFLs与GFRα和RET共同结合发挥其生物学效应，如果GFRα缺失，RET无法与任何GFLs结合。中枢神经系统（Central nervous system，CNS）中以GFRα1和GFRα2的表达为主，外周神经系统（Peripheral nervous system，PNS）中以GFRα3和GFRα4表达居多。生理状态下，神经元能够表达GDNF、GFRα1和RET（GDNF主要由神经元表达），而病理状态下，胶质细胞均能够表达GDNF，星形胶质细胞（Astrocyte，AS）表达GFRα1不表达RET［3］，小胶质细胞（Microglia，MG）表达RET不表达GFRα1，施万细胞（Schwann，SCs）表达GDNF、GFRα1不表达RET。GDNF是由二硫键连接的糖基化的同源二聚体，其相关受体有：GFRα1、RET、NCAM、Sydecan-3。RET是决定GDNF神经修复效应的主要信号受体，GFRα1是细胞膜表面的GDNF的结合受体，它还存在一种可溶性受体的形式。除运动神经元外，所有神经元表达的GFRα1都要由TGF-β激活才能够转运至细胞膜上。GFRα1从胞外捕获GDNF将其传递给RET。GDNF除与GFRα1和RET共同结合外还能够以NCAM为信号受体，以GFRα1的N端与NCAM的第四Ig结构域结合形成GFRα1-NCAM受体复合物，与GDNF结合实现NCAM下游的细胞内信号传导。也有研究发现，GDNF可在缺失GFRα1的情况下直接与syndecan-3结合保护神经元［1］。

2 GDNF抑制神经炎症发展

2.1 GDNF对MG的相关作用和机制MG起源于髓系卵黄囊原始巨噬细胞，和AS一起参与CNS的炎症反应，是CNS的驻留巨噬细胞，在固有免疫、维持内环境稳定、促进轴突再生和髓鞘形成等方面有重要作用［4］。SCI引起损伤组织的缺血缺氧，诱导TNF-α等炎症物质产生，使MG活化为M1，释放TNF-α、IL-1β等促炎因子［5-9］，同时MG内的RET表达增加，激活TLR4/NF-κB通路进一步促进M1的活化［10］。M1释放的促炎因子还能够诱导AS活化为A1，释放C3等促炎物质，MG和AS在神经炎症的发展中存在级联放大作用（图1）。GDNF能够与可溶性GFRα1及MG表面的RET结合，通过激活PI3K/Akt和Hippo/YAP信号通路、抑制TLR4/NF-κB信号通路来抑制MG活化为M1，促进其向M2转变，释放IL-4、IL-10等抗炎物质，抑制炎症发展［9］。同时提高血-脑脊髓屏障紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-3的表达，降低SCI引起BSCB的高通透性，减轻脊髓水肿，促进SCI的修复［11-12］。还能够激活MAPK/ERK信号通路促进MG整合素a5的表达，促进MG向炎症区域的迁移。但GDNF增强MG的吞噬活性的作用是否是由于整合素a5表达增加所致，还有待验证。此外GDNF还可以提高MG的SOD酶的活性（GDNF浓度较低时并不能增加MG的SOD酶的活性），激活MG的内源性抗氧化系统，抑制氧自由基等有害物质对受损组织修复的不利影响，促进神经细胞存活。

图1 小胶质细胞和星形胶质细胞在SCI中的相互作用

2.2 GDNF对AS的相关作用和机制AS是哺乳动物CNS中数量最多的胶质细胞，能够调节机体神经递质释放和神经血管动力学效应，为神经元运输能量物质及代谢产物、维持内环境稳态及BSCB的完整性及其正常功能、调节神经炎症和促进突触形成及可塑性等方面发挥重要作用［6，13］。SCI引起组织缺血缺氧及MG活化释放的促炎物质，使AS中GDNF及GFRα1的表达增多并诱导AS激活为A1释放补体C1r、C1s、C3、C4和TNF-α等有害物质（其中C3是A1的标志物）引起炎症反应和反应性星形胶质细胞（Reactive astrocyte，RAS）增生并与MG共同作用导致神经元和成熟少突胶质细胞死亡。GDNF能够抑制AS活化促进其向A2转变并向损伤部位迁移，同时促进AS存活并上调抗炎细胞因子TGF-β的表达，促进轴突的形成和神经保护［5］。GDNF还能够通过抑制Caspase-3/Akt通路的激活来减少AS死亡［3］。但是研究发现，增加GDNF的浓度并不能增加AS的数量，而GDNF抑制AS活化并促进其转变为A2的作用机制尚不清楚［6］。GDNF可以有效降低GFAP表达，在与SCs联合应用还能够诱导二者的直接接触及交叉迁移，逆转AS肥大，减少RAS增生，促进轴突再生［8］。

3 GDNF促进神经修复

3.1 GDNF促进神经元的存活修复GDNF能够促进多种神经元的存活修复，并能够增强脊髓γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）能神经元的可塑性、促进GABA递质释放、轴突再生及延长、突触形成等，促进SCI的修复并改善疾病的功能预后。GDNF能够激活MEK/ERK信号通路，使突触蛋白Ⅰ和突触素等蛋白水平升高，促进轴突延长、突触形成及可塑性［14］。GDNF通过增加N型钙离子通道、ERK依赖性电压门控通道的Ca2+浓度促进GABA神经元的递质释放来抑制MG活化，释放促炎细胞因子、减少局部组织的氧耗量和血流量，促进损伤组织修复。GDNF能够有效抑制SCI引起的乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）外漏，维持神经元细胞膜的完整性并维持和促进线粒体膜电位的稳定性。GDNF可以减少SCI后N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）引发的钙内流，抑制细胞毒性物质释放（注意，GDNF不能抑制由非N-甲基-D-天冬氨酸激动剂引起的细胞兴奋性毒性反应），GDNF抑制凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及自噬诱导蛋白Beclin-1、LC3的表达，上调BCL-2、HSP60的表达水平，抑制神经元的死亡，提高SCI后神经元的生存率［14-15］。

3.2 GDNF促进轴突的再生、髓鞘形成GDNF能够对神经元内的微管和微丝进行调控，促进Tau蛋白、乙酰化微管蛋白等的表达，促进微管聚合和动态组装、增强微管的稳定性并控制神经元胞体极化，诱导细胞微管极化至轴突末端，促进生长锥的迁移和延长。GDNF还能够提高SCI后GAP-43、NF-200、MAP等蛋白的表达，促进较厚且致密的髓鞘形成，同时促使神经纤维沿轴突纵轴走形，促进有髓轴突的形成及定向延长［15］。GDNF还能够调节N-cadherin/β-catenin通路协调修饰突触组装和可塑性，在突触发育中起到关键作用［16］。

4 GDNF与其他物质在神经修复中的联合应用

4.1 GDNF与生物支架在神经修复中的联合应用GDNF为大分子蛋白类物质，半衰期短，理化性质不稳定，静脉及经消化道给药的效果不理想。且GDNF不能通过血脊髓屏障，这极大地限制其在脊髓损伤中的应用，而通过原位注射等方法直接作用于脊髓部位又会造成局部药物浓度过高引起神经细胞的异常发芽、蛋白水解酶的破坏等问题，直接影响脊髓修复。而用生物支架包载GDNF治疗SCI的应用，有效解决这一难题，较常见的生物支架有：壳聚糖、纤维蛋白（Silk-fifibroin，SF）、温敏型肝素-泊洛沙姆（Heparin-poloxamer，HP）水凝胶等。壳聚糖生物毒性小，在体内能被降解为单糖为机体所用，具有良好的生物相容性，能够抑制纤维瘢痕的形成。黄成等［17］用水溶性较高的季铵盐壳聚糖与甘油磷酸钠复合成水凝胶支架，作为GDNF的载体同时包载干细胞进行联合应用，在体外实验中有利于细胞的生长与向神经细胞的定向分化。但是都未对其力学特性和控释作用进行详细说明，在SCI的应用中存在易变形的可能。辛林伟等［18］用胶原-壳聚糖制作的一种半透明多孔海绵状结构的圆柱形神经导管，耐组织挤压同时韧性较无机材料低不易引起神经嵌顿，且在组织中几乎完全降解。能够连接断裂轴突的两个残端，促进轴突定向生长。丝素蛋白（Silk-fifibroin，SF）是经FDA批准的一种成熟的组织支架生物材料，具有抗打结、可缝合的特点，其力学特性与脊髓组织相似，具有良好的组织相容性，并能够支持和促进细胞和组织的生长，在组织中可缓慢降解。JIAO等［19］从棕色海藻中提取的一种微球且表面多孔的阴离子聚合物海藻酸盐（Alginates，AGs），利用其生物相容性、高吸水性等特点作为GDNF的控释载体，同时以SF作为支架材料制作出SF/AGS支架复合物，来包载人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）和GDNF治 疗SCI。SF/AGs能 够 保 证GDNF的生物活性并能够控释GDNF达10天以上，同时还能够增强GDNF和hUCMSCs对脊髓损伤后运动功能的改善作用。CARVALHO等［20］自主研发了一种酶交联纤维蛋白导管（Enzymatically crosslinked silk-fifibroin，ESF）用于外周神经损伤的治疗。通过酶交联的方法使ESF来负载生长因子。而GDNF与NGF相比对ESF的亲和力更高，包埋率更高，能够更持久的控释，从ESF导管对GDNF的控制性释放能够持续到50天。ESF负载生长因子能够在保证其生物活性的同时实现跨越长神经间隙的神经再生。温敏型肝素-泊洛沙姆水凝胶为肝素与泊洛沙姆407结合形成的复合物［21］，HP即保留了肝素对蛋白类药物的高亲和力及肝素的抗凝作用，又具有泊洛沙姆的温敏特性及三维结构，保证多种生长因子生物活性的同时能够发挥稳定控制作用30天以上，LI等［22］对HP的温敏特性和高效率包载进行了详细说明，并从流变学角度分析HP比单纯的泊洛沙姆407对温度上升更敏感，并能够增强GDNF类生长因子的神经修复能力。HP与以上所述的几种生物支架材料一样具有三维的多孔结构及良好的生物相容性，但是HP能够有效抑制SCI引起的凝血异常，避免高凝状态对SCI修复的不利影响，相比较而言HP更有利于SCI修复［15，21-23］。

4.2 GDNF与干细胞在神经修复中的联合应用GDNF与干细胞在神经修复中的联合应用，能够有效提高移植干细胞的存活、促进其生长增殖及分化，同时能够有效发挥促神经元存活、轴突再生延长、抑制胶质瘢痕形成、抗细胞凋亡等作用。目前GDNF是否能促进干细胞分泌多种生长因子现在尚不明确，但GDNF能够以慢病毒为载体对干细胞进行基因修饰促进干细胞表达更多的GDNF。GDNF与施万细胞联合应用能够诱导星形胶质细胞与干细胞直接接触从而促进二者之间的交叉迁移同时抑制GFAP的表达，抑制胶质瘢痕的形成，促进施万细胞的髓鞘形成，促进有髓轴突的再生及远距离延长。GDNF和骨髓间充质干细胞的共同作用，抑制SCI中MG的活化，并抑制MG转化为M1型，促使其向M2转变。同时抑制SCI引起的乳酸脱氢酶的外漏、维持神经元内线粒体膜电位的稳定，促进神经元的存活。还能够有效减少细胞毒性物质的释放和中枢病理性疼痛的产生和持续。GDNF与hUCMSCs一起使用能够更加有效的促进MAP2、NeuN和Nestin蛋白的表达，促进神经元的再生修复及微管的稳定、轴突的远距离延长、hUCMSCs向神经元定向分化，还能够有效抑制IL-1β、IL-6和TNFα等炎性物质释放［19］。GDNF与干细胞联合应用及通过病毒对干细胞进行GDNF基因修饰用于治疗SCI［24-26］，是目前的研究热点。为SCI的治疗打开了新的思路和方法。

5 总结与展望

虽然已经证实GDNF具有促进损伤神经元的存活、轴突再生延长、髓鞘形成等神经修复作用，但是GDNF在抑制SCI后氧自由基和NO的产生、促进血脊髓屏障及血管系统的修复、抑制反应性星形细胞增生、调节星形胶质细胞的类型变化等方面的具体作用机制还不清楚，有待进一步研究。而在一定的浓度范围内GDNF的作用存在剂量依赖性，超出这个范围，较高浓度的GDNF反而会产生轴突异常发芽等不利作用。而目前采用多生长因子联合、干细胞与GDNF联合等多种应用方法又为SCI的治疗创新性的开拓了新的思路，GDNF的联合应用有很广阔的治疗前景，随着治疗手段和研究技术等的不断完善和进步，必定能在脊髓损伤中发挥重大作用，极大地推动脊髓损伤研究的进展。