肿瘤坏死因子α改变人脐带间充质干细胞的生物学特性并降低其免疫调节能力

胡彩东，林传明，许 希，谢水玲，李海亮，刘礼平

（赣南医学院第一附属医院血液科，江西 赣州 341000）

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是可分化为骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪等多种组织细胞的一类具有自我更新能力的间质干细胞［1］，可从脐带、脐带血、胎盘等组织中分离得到［2-3］。人脐带间充质干细胞的鉴定现主要根据其表达表面分子CD105（SH2）、CD73（SH3/4）、CD29及表达HLA-Ⅰ类基因，不表达造血干细胞表型CD34、CD45和CD14，不表达协同刺激因子CD80、CD86和CD40，不表达HLA-Ⅱ类基因，表现为低免疫原性［4］。有研究发现，MSCs具有广泛的免疫调节作用，在固有免疫及获得性免疫反应中均有体现：MSCs可通过下调NK细胞表面受体NKp30和NKG2D的表达，抑制固有免疫中NK细胞的杀伤能力［5］；MSCs可抑制由CD14+细胞诱导产生DC细胞这一过程，且可直接抑制DC1细胞分泌TNF-α，促进DC2分泌IL-10［6］；MSCs可抑制淋巴细胞增殖；抑制TH1细胞分泌INF-γ，促进TH2细胞分泌IL-4，并通过介导IL-10的分泌促进调节性T细胞（Treg）的生成［7］。然而间充质干细胞的免疫抑制机制尚未完全明了，现有的实验研究表明可能与MSCs介导产生转化生长因子（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、吲哚胺2，3-双加氧酶（Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、一氧化氮（NO）、前列腺素（PGE2）等有关。基于MSCs的免疫调节功能，目前已广泛运用于移植物抗宿主病、风湿性关节炎、糖尿病足等多种疾病的治疗［8-9］。MSCs可在炎症介质的介导下聚集到炎症部位发挥免疫调节作用，这就使得MSCs与炎症因子的接触不可避免。在体外实验中，TNF-α可通过调控T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫细胞参与细胞免疫及体液免疫。前期研究表明，TNF-α及IL-4可影响hUC-MSCs的造血支持能力［10］，其作用可能与TNF-α诱导UC-MSC分泌IL-6有关。本文从hUC-MSCs的干细胞特性及免疫调节能力入手，研究炎症因子TNF-α对其影响，为解释不同病理条件下应用间充质干细胞产生生物学效应差异提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器DMEM/F12干粉培养基，胰酶（Gibco公司，美国）；胎牛血清（FBS）（Hyclone公司，美国）；人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司，中国）；TNF-α、CD34-FITC、CD11b-PE、CD19-PE、CD29-PE、CD54-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD80-PE、CD86-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD117-PE、HLA-DR-PE、HLA-G-PE（BD-Biosciences公司，美国）；油红O、茜素红（Sigma公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；流式细胞仪（Becton Dickinson公司，美国）；E.Z.N.A总RNA提取试剂盒（Omega公司，美国）；M-MLV逆转录试剂盒（Invitrogen公司，美国）；各种PCR引物（Invitrogen公司，美国）。

1.2 主要实验方法

1.2.1 hUC-MSC分离培养扩增和鉴定在获得知情同意后，收集足月妊娠的脐带，用缓冲液冲洗脐带，剪碎后用胶原酶和胰酶各消化30 min。滤网过滤消化的产物，去除没有消化完全的组织块。将悬液离心后弃上清液，加入含10%胎牛血清、100 U·mL-1青/链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀，转移至细胞培养瓶中，于37℃培养箱中培养。在细胞生长至80%融合时，按1∶3比例进行传代扩增。通过显微镜下观察细胞生长形态、流式细胞术检测细胞免疫表型及进行成脂、成骨分化实验，鉴定所得细胞为人脐带间充质干细胞，实验方法同如下实验。

1.2.2 TNF-α对人脐带间充质干细胞增殖能力的影响复苏P3～P6代hUC-MSC以3×103/孔的浓度用DMEM/F12完全培养基接种于96孔板内，培养4 h至细胞完全贴壁后，更换培养基，实验组为DMEM/F12完全培养基加TNF-α（10 ng·mL-1），对照组为DMEM/F12完全培养基。分别于培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h加入MTS 10μL，于培养孵箱中孵育4 h后，酶标仪45 nm波长检测OD值。

1.2.3 TNF-α对人脐带间充质干细胞表型的影响取稳定传代第3代hUC-MSCs复苏接种培养，至80%～90%融合时消化传代，平均接种至2个培养瓶中，细胞生长至60%融合时，均全量换液，实验组加入TNF-α（10 ng·mL-1），另一瓶作为对照组。24 h后消化收集细胞，藻红蛋白（PE）标记鼠抗人抗体CD29、CD11b、CD19、CD45、CD54、CD73、CD80、CD86、CD105、CD117、HLA-G，异硫氰酸荧光素标记鼠抗人抗体CD34、CD90、CD31、HLA-DR，以PE-IgG1和FICT-IgG1作为同型对照。

1.2.4 TNF-α对人脐带间充质干细胞成脂、成骨分化能力的影响复苏P3～P6代脐带间充质干细胞，按2×104/孔浓度接种至24孔板内，分实验组与对照组，每组3个复孔。在DMEM/F12完全培养基中培养至完全贴壁后，分别更换为成骨、成脂分化培养基。成脂诱导培养基成分为：IMBM培养基、10%FBS、100 U青/链霉素、2 mM左旋谷氨酰胺、1μM地塞米松、0.5μM IBMX、Insulin10μg·mL-1、100μM吲哚美辛。成骨分化培养基成分为：IMBM培养基、10%FBS、100 U青/链霉素、2 mM左旋谷氨酰胺、0.1μM地塞米松、0.2μM vitC，10μMβ-磷酸甘油。终量1 mL/孔，实验组加入TNF-α（10 ng·mL-1）。每3～4天换液，共培养3周。3周后分别用油红O染色成脂分化组，茜素红染色成骨分化组，显微镜下观察hUC-MSC成脂、成骨分化情况，并倒置显微镜拍照。

1.2.5 TNF-α对脐带间充质干细胞-单个核细胞共培养体系的影响复苏P3～P6代脐带间充质干细胞，按3×103/孔接种于96孔板，细胞贴壁4 h后，弃培养基，加入采用Ficoll分离得到的人外周血单个核细胞，脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞按1∶5和1∶20接种，用1640培养基200μL重悬。分为以下几组：实验组［hUC-MSC＋hPBMC＋TNF-α（10 ng·mL-1）＋PHA］；对照组（hUC-MSC＋hPBMC＋PHA）；阳性对照组（hPBMC＋PHA）；阴性对照组（hPBMC）；单独1640完全培养基组。于37℃、5% CO2饱和湿度孵箱中培养72 h后收集上清。按照试剂盒说明书进行操作，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组上清中IFN-γ含量。

1.2.6 RT-PCR检测实验组与对照组hUC-MSCs中IDO的表达收集上述实验组与对照组hUC-MSCs，提取RNA并逆转为cDNA，行RT-PCR检测IDO基因表达量，反应条件为95℃2 min激活热启动酶，94℃15 s，60℃30 s，45个循环扩增，60℃收集荧光信号。

1.3 统计学分析与方法数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hUC-MSC形态与表型特征显微镜下见脐带间充质干细胞贴瓶壁生长，长梭形，于第3 d融合度达80%～90%，呈旋涡状排列。待细胞融合达70%～80%时，加入TNF-α刺激24 h后形态未见明显改变（图1）。

图1 两组hUC-MSCs的形态观察

实验组（TNF-αgroup）为DMEM/F12完全培养基加TNF-α（10 ng·mL-1），对照组（control group）为DMEM/F12完全培养基。流式细胞仪检测实验组与对照组hUC-MSC细胞表型，结果显示，实验组与对照组均不表达CD11b、CD19、CD34、CD31、HLA-DR，其他标志物表达见表1。其中实验组hUC-MSC表面CD106、CD54表达量上调，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（图2）。

表1 两组人脐带间充质干细胞标志物表达谱（n=3）

图2 流式细胞仪检测两组人脐带间充质干细胞CD54和CD106的表达

2.2 TNF-α刺激对人脐带间充质干细胞成骨成脂分化潜能的影响如图3所示，在hUC-MSC成骨分化实验中，实验组钙盐形成体积较对照组小；油红O染色成脂分化，两组脂滴形成未见明显差异。

图3 两组hUC-MSCs的成骨成脂分化能力

2.3 TNF-α对人脐带间充质干细胞增殖能力的影响如图4所示，在0 h、24 h、48 h实验组和对照组相比无明显差异，72 h、96 h实验组hUC-MSCs的增殖能力较对照组弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 两组hUC-MSCs的增殖能力

2.4 TNF-α对人脐带间充质干细胞免疫调节功能的影响TNF-α预处理24 h后的hUC-MSC与PBMC按1∶5和1∶20数量共培养，ELISA检测上清中IFN-γ的分泌量，如图5所示，其中PP为阳性对照组，S为实验组，U为对照组，阴性对照为PBMC与单纯1640培养基组，未检测到IFN-γ分泌，未在图中显示。实验组和对照组hUC-MSCs均对PBMC分泌IFN-γ表现出抑制效果，但当比例扩大到1∶20时，实验组该抑制效果较对照组弱，差异有统计学意义（P=0.017）。

图5 ELISA Kit检测两组hUC-MSCs与hPBMCs共培养体系上清中IFN-γ的分泌量

2.5 TNF-α下调人脐带间充质干细胞IDO的表达如图6所示，S为实验组，U为对照组，实验组hUC-MSC的IDO表达量较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图6 两组人脐带间充质干细胞IDO的表达

3 讨论

脐带间充质干细胞具有低免疫原性，即使在TNF-α（10 ng·mL-1）刺激24 h后仍低表达HLA-Ⅱ基因及共刺激分子CD80、CD86，这是hUC-MSC进行异种移植治疗的基础［11］。CD54是一类重要的细胞间黏附分子［12］，白细胞表面表达其配体，而TNF-α刺激后hUC-MSC表达CD54上调，可促进血液中免疫细胞黏附于其表面，而在hUC-MSC与PBMC共培养时，镜下亦可见PBMC成小团黏附于hUC-MSC上，这可能有利于间充质干细胞发挥其免疫调节作用。其次CD106（血管内皮细胞黏附分子）主要表达于造血系统的绝大部分细胞［13］，如造血干细胞、B细胞、T细胞、单核细胞、粒细胞等［14］。CD106作为黏附因子可介导白细胞与血管内皮细胞的黏附，表现在白细胞的迁移等过程中，白细胞先黏附于血管内皮细胞，在各种趋化因子的介导下通过内皮细胞之间的细胞间隙到达炎症部位，CD54可在其中起协同作用［15］。然而多个研究表明，炎症因子对MSCs表面分子的影响具有时间特异性，TNF-α对CD106的诱导在2 h后开始呈现，于10～24 h达到高峰，之后由于TNF-α可诱导CD106 mRNA降解而逐渐下降［16］，这也可能是后续实验中经TNF-α刺激的hUC-MSC抑制T细胞分泌IFN-γ未表现出优势的原因之一。

在本研究成脂成骨分化实验中，TNF-α刺激后hUC-MSC均能在21 d内生成钙盐及脂滴，说明其干性存在，但成骨能力有所降低。据现有文献报道，TNF-α本身可抑制骨形成促进骨流失，同时TNF-α可通过泛素E连接酶WwpⅠ抑制MSC成骨分化［17］。然而也有研究表明TNF-α可通过激活NF-κB途径促进脂肪组织来源MSCs成骨分化［18］。另外在hUC-MSC增殖实验中，我们发现TNF-α刺激后hUC-MSC在第3 d即其倍数增长期的速度降低，然而有文献报道TNF-α可通过NF-κB途径刺激骨髓来源MSC增殖，同时上调BM-MSC周期蛋白D1［19］，这可能是脐带来源MSCs与骨髓来源MSCs的不同之处，具体机制还有待深入研究。

现有的实验研究表明，MSCs可介导外周血细胞产生IL-10、TGF-β、HGF、IDO、NO及PGE2等，以发挥免疫调节作用［20-21］。IFN-γ作为一类重要的炎症因子，在天然免疫中主要由NK和NKT细胞分泌，在抗原特异性免疫中由Th1和CD8细胞毒性T细胞分泌，广泛存在于病毒细菌等引起的炎症反应中。本实验主要观察TNF-α（10 ng·mL-1）刺激后hUC-MSC与PBMC共培养体系中IFN-γ的浓度变化，这对hUC-MSC运用于各种移植治疗及自身免疫性疾病治疗有重要意义。设计脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞比例为1∶5和1∶20，通过3个不同个体来源hUC-MSC重复实验，发现实验组［hUC-MSC＋PBMC＋TNF-α（10 ng·mL-1）］、对照组（hUC-MSC＋PBMC＋PHA）IFN-γ分泌量均低于阳性对照组（PBMC＋PHA），实验组（hUC-MSC＋PBMC＋TNF-α（10 ng·mL-1）IFN-γ分泌量高于对照组（hUC-MSC＋PBMC＋PHA），且1∶5时实验组与对照组差异无统计学意义，而1∶20时两组间差异有统计学意义，这说明脐带来源MSC具有免疫调节作用，且TNF-α刺激可影响hUC-MSC对PBMC分泌IFN-γ的作用，但该影响力度受细胞浓度影响。我们通过RT-PCR实验发现TNF-α刺激后可下降hUC-MSC的IDO表达量，推断这可能是TNF-α使hUC-MSC免疫调节能力下降的原因之一。本实验所采用的TNF-α的浓度是经多个预实验及查阅相关文献，同时对比免疫异常疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等疾病患者体内TNF-α浓度确定的。不同细胞因子浓度对hUC-MSC的影响有待进一步研究。

综上所述，TNF-α刺激24 h后可上调hUC-MSC的表面分子CD54、CD106的表达，降低其增殖能力。另外，TNF-α可通过下调hUC-MSC IDO的表达以降低其免疫调节能力，这为解释不同病理条件下应用间充质干细胞产生生物学效应差异提供了理论依据。