IL-6在深静脉血栓疾病中的作用研究

郭阗廷，石 锦，戴 鹏，熊丽娇，莫建文

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院第一附属医院骨科；3.赣南医学院第一附属医院VIP科，江西 赣州 341000）

深静脉血栓（Deep venous thrombosis，DVT）常发生在下肢深静脉中，常见于股深静脉、髂静脉等。深静脉血栓栓塞（Venous thromboembolism，VTE）是造成全球残疾和死亡的主要原因之一，发病率约为12/10万［1］，为最常见的急性心血管综合征之一，随着人口老龄化加剧发病率持续增高。DVT最严重的并发症是栓子随血流进入肺动脉，造成肺动脉栓塞（Pulmonary embolism，PE）。传统上认为DVT的形成是由血液瘀滞、血管内皮功能障碍和血液高凝性引起的。目前研究显示DVT也与炎症过程密切相关［2］。但DVT形成的炎症相关机制尚未全面阐明，探索特异性治疗靶点仍需进一步探索。

白细胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）是一种主要由炎症细胞产生的炎症因子，它具有白细胞趋化作用等复杂的生物学功能［3］，IL-6在炎症的发生和发展中具有重要的作用。

凝血过程是复杂的多因素综合作用的结果［4］，其中炎症在血栓的形成中具有重要的意义，但抑制IL-6能否影响深静脉血栓形成尚未明确。本研究对创伤性深静脉血栓模型动物进行IL-6基因干扰。将IL-6基因干扰模型动物血栓形成情况与应用经典抗凝血药物低分子肝素钙的模型动物血栓形成情况进行对比研究，为IL-6与深静脉血栓形成之间的关系提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组SPF级SD大鼠（雄性，200～250 g）30只，由赣南医学院动物中心提供，饲养于赣南医学院实验动物中心，饲养环境：室温20℃～25℃，湿度50%～60%，常规光照，通风良好，自由饮水、进食；实验前均适应性喂养3～5 d。实验过程中对动物的处置符合2006科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，所有动物实验均经伦理委员会批准。随机分为5组：AA组（si-RNA组）、BB组（model组）、CC组（507 si-RNA病毒组）、DD组［低分子肝素组（LMWH组）］、EE组［正常对照组（control组）］，每组6只。

1.1.2 试剂及仪器1640基础培养基（Gibco公司，美国）、胎牛血清（Gibco公司，美国）、Lipo 3000转染试剂（Thermo Fisher，美国）、Opti-MEM Gibco siRNA干扰套餐（3条特异性IL-6 siRNA阴性对照、阳性对照、FAM-siRNA）（上海生工生物工程有限公司，中国）、TRNzolTM Reagent（Thermo Fisher，美国）、逆转录试剂盒（Takara，日本）、实时荧光定量试剂盒（Takara，日本）、上下游引物（上海生工生物有限公司，中国）、PCR仪BIOMETRA T1-96（Thermo Fisher，美国）、实时荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX Connect Real-Time System（Thermo Fisher，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组常规培养大鼠大隐静脉细胞：细胞购置于中国科学院上海生科院细胞资源中心。收到细胞后于37℃5%CO2细胞培养箱中静置6～8 h后进行换液，采用1640基础培养基＋10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）＋1%双抗（青霉素＋链霉素）培养，细胞覆盖率至80%～90%进行传代。细胞形态稳定后应用于实验。

细胞分组和转染效率研究：将大鼠大隐静脉内皮细胞分为6组：A（184-si-RNA）、B（424-si-RNA）、C（507-si-RNA）、D（阴性基因对照）、E（单纯转染试剂）、F（空白对照）。常规培养的大鼠大隐静脉内皮细胞，当细胞覆盖皿底约70%时，按照分组A、B、C、D组加入相应基因型lipo3000-siRNA混合液，E组细胞单纯加入lipo3000转染试剂，F组细胞正常培养不进行特殊处理仅加入相应体积的生理盐水。按试剂盒要求进行转染操作并应用ELISA法筛选转染抑制IL-6效率最高的si-RNA进行下一步研究。

1.2.2 IL-6干扰效率检验

1.2.2.1 RT-PCR法检测IL-6干扰效率使用PrimeScriptTM试剂盒提取血管内皮细胞株总RNA。根据试剂盒使用说明书，使用cDNA合成试剂盒，合成第一链cDNA。采用Bio-Rad CFX Connect Real-Time System荧光定量PCR仪进行实时PCR检测IL-6 mRNA表达水平，以β-actin为内参（引物序列见表1）。使用比较循环阈值（Ct）计算基因的相对表达（2－△△Ct），实验重复3次。

表1 引物序列

1.2.2.2 ELISA法检测IL-6干扰效率将转染的大鼠内皮细胞按分组，取上清，低速冷冻离心3 000 rpm 5 min，并用大鼠IL-6 ELISA试剂盒，按照操作说明书进行操作，各个孔中加入终止反应液50μL使其终止反应，后将酶标板放入酶标仪中读取各孔OD值，画出标准曲线，计算各孔浓度。统计后依据统计结果选择合适的si-RNA。

1.2.3 动物转染及建模随机数字法进行分组：分别为AA（正常对照组）；BB（模型组）；CC（模型＋si-RNA）；DD（模型＋低分子肝素钙LMWH）；EE（模型＋空RNA载体组），每组6只。按分组要求于CC组经尾静脉注射1 mL的siRNA，EE组经尾静脉注射1 mL的RNA空载体，注射后3只1笼，饲养4周；4周后，除正常对照组外均采用定量钝性打击装置造模：采用3℅戊巴比妥钠溶液，按1 mg·kg-1剂量静脉注射麻醉大鼠。麻醉起效后采取创伤定量打击装置，瞬间打击能量为5 J［5］，分别击打大鼠双侧大腿近端外侧各1次（大转子至大转子下1 cm）。经骨擦感或反常活动证实造成股骨骨折后。于双侧大腿近端内侧股静脉走行区的表面石膏固定［6］，局部开窗以便观察血栓的形成情况。造模后实验大鼠自由进食、饮水，不用止血剂及抗生素。DD组（低分子肝素组）造模后每天注射等量的低分子肝素钙［410 IU·（kg·d）-1］，120 h后所有实验动物包括正常对照组统一取材。

1.2.4 深静脉血栓发生率3%戊巴比妥钠麻醉后将模型动物处死，将取材后的大鼠深静脉进行大体测量产生深静脉血栓例数。

1.2.5 ELISA法检测各组大鼠血清中IL-6的表达麻醉成功后，将大鼠按分组抽取下腔静脉中血液常温静置5 min后，低速冷冻离心3 000 rpm 5 min，并用大鼠IL-6 ELISA试剂盒，按照操作说明书进行操作，各个孔中加入终止反应液50μL使其终止反应，后将酶标板放入酶标仪中读取各孔OD值，画出标准曲线，计算各孔浓度。

1.2.6 RT-PCR检测各组大鼠深静脉组织IL-6 mRNA的表达麻醉成功后将大鼠下肢深静脉剥离，去除血栓后用1×PBS溶液清洗3次，充分剪碎、匀浆。使用PrimeScriptTM试剂盒提取血管内皮细胞株总RNA。根据试剂盒使用说明书，使用cDNA合成试剂盒，合成第一链cDNA，采用Bio-Rad CFX Connect Real-Time System荧光定量PCR仪进行实时PCR检测IL-6 mRNA表达水平，以β-actin为内参（引物序列同表1）。使用比较循环阈值（Ct）计算基因的相对表达（2－△△Ct），实验重复3次。

1.2.7 Western Blot检测各组大鼠深静脉组织IL-6蛋白的表达收集各组大鼠深静脉（去除血栓）标本充分剪碎后添加含PMSF（sigma公司）的RIPA裂解液（Beyotime），冰浴30 min；4℃12 000 r·min-1离心5 min；取上清液，用BAC法测定计算总蛋白浓度。应用蛋白免疫印迹法（Western Blot法）分析目标蛋白的表达，应用BIO-RAD膜成像系统显色成像并用Quantilty One软件进行对比分析。

1.3 统计学方法数据采用Prism 8.0软件进行分析。所有数据以±s表示，组间各测定指标比较采用单因素方差分析，组内各指标的多重比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 转染si-RNA对血管内皮细胞IL-6 mRNA表达的影响RT-PCR法检测转染细胞中IL-6 mRNA相对表达情况，共分为184 IL-6 si-RNA组、424 IL-6 siRNA组、507 IL-6 si-RNA组、阴性对照组、单纯转染试剂组和空白对照组。结果显示：与空白对照组相比，单纯转染试剂组、阴性对照组IL-6 mRNA表达均无统计学意义（P＞0.05）；507 IL-6 si-RNA组IL-6 mRNA表达最低，且与424 IL-6 siRNA组、阴性对照组和空白对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 各组大鼠血管内皮细胞IL-6 mRNA的表达

2.2 Elisa法检测si-RNA转染对大鼠血管内皮细胞上清液中IL-6表达的影响Elisa法检测转染细胞上清液中IL-6表达情况，共分为184 IL-6 si-RNA组、424 IL-6 siRNA组、507 IL-6 si-RNA组、阴性对照组、单纯转染试剂组和空白对照组。结果显示：与空白对照组相比，单纯转染试剂组、阴性对照组上清液IL-6表达均无统计学意义（P＞0.05）；507 IL-6 si-RNA组上清液IL-6表达最低，且与184 IL-6 si-RNA组、424 IL-6 siRNA组和空白对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 各组大鼠血管内皮细胞上清液中IL-6的表达

2.3 免疫荧光验证转染效率免疫荧光法观察验证507 si-RNA通过载体转染进入实验大鼠静脉内皮细胞（图3）。

图3 免疫荧光验证转染效率

2.4 实验动物产生深静脉血栓数量sham组未形成血栓；model组3只出现血栓，血栓形成率为50%；model+si-RNA组2只形成血栓，血栓形成率33.3%；model+LMWH组3只形成血栓，血栓形成率为50%；model+空载体组4只形成血栓，血栓形成率为66.6%（图4）。

图4 各组深静脉血栓形成率

2.5 病毒转染对大鼠血清IL-6表达的影响与sham组相比，model组血清IL-6水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与model组相比，model＋si-RNA组血清IL-6水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与model＋si-RNA组相比，model＋LMWH组血清IL-6水平增高，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5）。

图5 各组大鼠血清IL-6的表达

2.6 病毒转染对大鼠深静脉组织IL-6 mRNA表达的影响与sham组相比，model组IL-6 mRNA水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与model组相比，model＋si-RNA组IL-6 mRNA水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与model＋si-RNA组相比，model＋LMWH组IL-6 mRNA水平增高，差异有统计学意义（P＜0.01）（图6）。

图6 各组大鼠深静脉组织IL-6 mRNA的表达

2.7 病毒转染对大鼠深静脉组织IL-6蛋白含量的影响与sham组相比，model组IL-6蛋白表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与model组相比，model＋si-RNA组IL-6蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与model＋si-RNA组相比，model＋LMWH组IL-6蛋白表达水平增高，差异有统计学意义（P＜0.01）（图7）。

图7 各组大鼠深静脉组织IL-6蛋白含量

3 讨论

深静脉血栓是一种严重影响人类健康的疾病，它具有发病率高、后果严重的特点。随着老龄化的加剧，深静脉血栓的发病率也呈逐步增高的趋势。研究表明深静脉血栓形成与炎症具有密切的关系［2］。炎症因子种类繁多，白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）是由B细胞、单核/巨噬细胞、活化的T细胞产生，通过旁分泌、自分泌和内分泌方式发挥免疫调节作用的一种细胞因子［7］。它具有多种生物学功能，可以刺激炎症细胞进行趋化并刺激中性粒细胞、血管内皮细胞等释放炎症因子进一步促进炎症反应。

siRNA是指将双链RNA进入细胞后，发生降解与mRNA特异性结合，导致mRNA的沉默从而不表达目的蛋白［8］，其在转录水平上抑制基因的表达。siRNA为双链RNA，长度较短，主要介导短期的RNA干扰，干预特定蛋白的表达。我们通过向血管内皮细胞中定向导入507-siRNA靶向干扰大鼠血管内皮细胞IL-6的转录和表达。在实验中我们观察到，创伤性深静脉血栓模型动物中IL-6基因的转录和IL-6蛋白的表达均增加，同时提示IL-6是深静脉血栓形成中一个重要的分子，血管内皮细胞在受到炎症、创伤、缺血缺氧等刺激后，会激活相应的细胞信号传导通路，使IL-6释放增加。IL-6是重要的白细胞趋化因子，可以刺激单核巨噬细胞、粒细胞等炎症细胞局部聚集。同时单核巨噬细胞及受损的内皮细胞释放大量的肿瘤坏死因子（TNF-α）及IL-1，升高的TNF-α及IL-1一方面刺激单核细胞释放大量的组织因子（TF）［9-10］，另一方面与血小板上的Toll样受体（TLR）结合，激活NF-κB信号通路，导致IL-6的大量释放［11］。同时NF-κB信号通路的激活又进一步促进TNF-α及IL-1的表达，这就形成了炎症反应信号初期的“瀑布效应”［12］。大量释放的IL-6能够促进巨噬细胞的成熟，改变血小板活性，增加其促凝活性；同时能够诱导肝脏产生如C-反应蛋白、纤维蛋白原等这些急性反应蛋白，增加凝血因子的数量［13］；IL-6还可以促进细胞表达组织间黏附因子（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1），ICAM-1能够增强中性粒细胞黏附作用，能够促进中性粒细胞释放氧自由基，加重内皮细胞损伤促进血栓形成［14］。在实验中我们观察到当抑制血管内皮细胞IL-6产生时实验动物血栓形成的数量较模型组明显减少，并伴随着血清中IL-6含量降低。综合实验结果和相关文献我们可以推论IL-6是深静脉血栓形成过程中重要的一个因子，血管内皮细胞释放IL-6的含量与血栓形成呈正相关，且通过对血清IL-6含量的测定可以早期预测深静脉血栓的发生风险。

低分子肝素钙（LMWH）是临床常用的一种抗凝药物，其作用机制主要是通过抑制凝血因子Xa、白细胞促凝酶、单核细胞促凝因子等释放，特异性地阻断Xa与G蛋白偶连的蛋白酶激活受体3（PAR3），发挥抗炎作用。同时，LMWH还可促进内皮细胞合成并释放组织因子途径抑制因子（TFPI），通过刺激血管内皮释放纤溶酶原激活物，增强纤维蛋白溶解，减弱纤维蛋白原对红细胞、血小板的聚集桥联作用，从而抑制血液有形成分的聚集，减少血液高凝和高黏滞状态，并通过抑制凝血酶的作用来抑制内源性和外源性凝血机制［15］。有研究发现给小鼠注射5 000 U·kg-1低分子肝素能抑制TNF-α诱发的白细胞在内皮细胞上的滚动、黏附和组织浸润［16］。低分子肝素可能通过下调炎症介质IL-6、TNF-α的表达而实现抗炎作用［17］，并很可能通过干扰炎症细胞的组织浸润而抑制TNF-α诱发的白细胞在内皮细胞上的滚动、黏附和组织浸润，起到有效的抗炎作用［16］。在实验中我们也观察到了低分子肝素钙组的模型动物产生的IL-6较模型组降低，该结果提示低分子肝素很可能通过多种作用机制起到抗炎作用，且IL-6是其发挥抗凝作用中重要的分子。

目前认为IL-6参与血栓形成的机制可能有三种：⑴IL-6能够激活血小板，增加其促凝活性，促进血栓的形成；⑵IL-6能够诱导肝脏产生如C-反应蛋白、纤维蛋白原等急性反应蛋白，增加凝血因子的数量，最终在血栓形成过程中起促进作用；⑶IL-6还可以促进细胞表达ICAM-1，ICAM-1能够增强嗜中性粒细胞黏附作用，促进嗜中性粒细胞释放氧自由基，加重细胞损伤。研究表明，在大鼠创伤深静脉血栓模型中模型组IL-6水平较正常组升高，血栓形成率增高，当应用si-RNA抑制IL-6表达水平的降低，能够降低血小板聚集，从而抑制了血栓形成［18］；也有研究证明，阻断IL-6受体可大大减少血栓形成和小鼠炎症细胞募集，同时临床样本证明了IL-6还会使血小板与胶原受体相互作用，从而增加血小板聚集并引起血栓形成的倾向［19］。另一方面，IL-6的升高，经IL-6途径作用于肝脏，诱导肝脏释放急性期蛋白如C反应蛋白、纤维蛋白原和纤溶酶原等［20］，导致血液内凝血因子增多，加速血栓形成。最后，IL-6能够上调ICAM-1，募集白细胞和诱导平滑肌细胞迁移和增殖［21］，导致局部细胞增多，使得血液处于高凝状态，同时，ICAM-1能够促进嗜中性粒细胞释放氧自由基，加重局部细胞的损伤，进一步导致炎症因子的释放。

研究通过建立创伤性深静脉血栓动物模型，发现IL-6是深静脉血栓形成过程中一个重要的中间分子。并通过ICAM-1等分子调节局部炎症因子，影响局部炎症。使用si-RNA干扰IL-6的合成能有效减低创伤性深静脉血栓动物模型血栓生成率。低分子肝素钙主要是通过抑制凝血因子Xa产生抗凝作用，对比使用低分子肝素钙组动物的IL-6含量变化，我们推测抑制内皮细胞炎症反应，减低IL-6是低分子肝素钙可能的抗凝作用机制之一。实验结果我们推测IL-6含量与深静脉血栓形成正相关，观察血清IL-6含量的变化可能对深静脉血栓形成具有预测作用。