基于小鼠背脊皮翼视窗的肿瘤微环境活体可视化研究

江一航，肖辉雨，2，曹仲林，3，翟鹏，徐周睿，李丽，邹晓敏，马名泽，王晓梅，林桂淼，许改霞

1.深圳大学医学部生物医学工程学院，广东深圳518055；2.深圳市药品检验研究院，广东深圳518057；3.贵州民族大学材料科学与工程学院，贵州贵阳550025；4.深圳大学医学部，广东深圳518055；5.深圳大学医学部基础医学院生理学系，广东深圳518055

前言

肿瘤微环境是肿瘤发生、生长和转移的内环境，是由肿瘤细胞、肿瘤相关的成纤维细胞及其周围的组织、免疫细胞、血管、细胞外基质等共同形成的动态网络［1-3］。其中，肿瘤新生血管将提供肿瘤组织新陈代谢所必需的氧气和营养，以促进肿瘤的迅速生长。如果可以清晰观察肿瘤新生血管的形状及变化，便可实现肿瘤治疗及转移监测。肿瘤生长中血管的监测和成像对解析和干预肿瘤生长，相关药物研制、筛选和评价具有重要意义［4-6］。

背脊皮翼视窗（Dorsal Skin Fold Window Chamber,DSFC）是一种小动物活体原位光学成像的辅助工具，通过在小鼠或兔子身上构建可以进行光学成像的透明窗口，拓展成像深度，使肿瘤微环境的血管、细胞甚至血流状况得以可视化，大大提高了对病理生理学中微观血管化的理解［7-10］。Palmer等［11］介绍了DSFC用于活体小鼠光学功能成像的方法，指出视窗模型对于研究活体的基因表达、血管重塑、血管新生以及肿瘤生长和侵袭具有一定的应用价值。2018年，Staresinic等［12］利用DSFC模型评价钙电穿孔法的抗肿瘤效果，结果表明，钙电穿孔法对正常血管和肿瘤局部血管具有相同程度的作用，主要通过破坏血管导致肿瘤坏死。

活体光学成像是一种在亚细胞水平上研究生理和病理过程的无损、微扰的成像方法，已被证明是一种能够实现肿瘤发展监测、肿瘤治疗评估的强大工具［13-14］。活体光学成像技术具有高分辨率、高灵敏度、可视化、能够实时监测等优点，但是其成像深度浅，无法在传统小鼠肿瘤模型中获得肿瘤微环境的精确信息。

本研究利用转染了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的小鼠乳腺癌细胞（4T1）构建了DSFC 的乳腺癌荧光肿瘤模型，结合体视荧光显微镜和激光散斑成像（Laser Speckle Imaging, LSI）仪，连续监测活体小鼠肿瘤生长及肿瘤局部血管状态，同时采集肿瘤面积、体积、血管流量等参数随时间的动态变化数据。在此基础上，评价实验室前期开发的抗肿瘤基因纳米药物PCL-PDEM-siRNA［15］对小鼠视窗内肿瘤和肿瘤血管的抑制效果，揭示了该药物对4T1 乳腺肿瘤生长的连续动态作用效果。本研究为肿瘤微环境的精细化成像和定量分析提供了新的策略，对肿瘤生物学的基础研究和抗肿瘤药物研发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 细胞实验

细胞培养液由89%的RPMI-1640 培养液（购买于美国Gibco 公司）加入10%胎牛血清（购买于美国Thermo Scientific 公司）和1% 双抗（购买于美国Thermo Scientific公司）混合而成，37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中预热。4T1 细胞系（小鼠乳腺癌细胞，转染绿色荧光蛋白GFP）购于广州吉妮欧生物科技有限公司。按0.5×104个/孔密度将肿瘤细胞接种在12 孔板，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2 裸鼠背脊翼视窗肿瘤模型构建

根据实验的要求和目的，实验动物采用购自于广东省实验动物中心6～8 周龄22～25 g 的BALB/c 裸鼠于SPF条件下饲养，目的在于保证植入背脊翼视窗后裸鼠可以进行正常的饮食和作息，有利于实现活体动态连续监测。本研究中所有的动物手术和实验操作过程都严格遵照深圳大学实验室设备部和医学部动物实验伦理委员会的规定。在DSFC 手术和成像过程中，小鼠持续吸入1.5%异氟醚和30%氧气以及70%氮气的混合气体麻醉，维持核心温度为37 ℃。如图1 所示，小鼠麻醉状态下实施DSFC 手术，使用缝合线将皮肤固定于视窗框架，视窗玻片直接嵌入皮肤开口处［16-18］。待小鼠生长状态稳定后，微量进样针取5.5×105个4T1 细胞从视窗区域外部皮下注射，将细胞注射在于视窗中央血管交汇处。肿瘤生长至第4天，根据视窗内图像判断肿瘤视窗模型是否构建成功，成功模型应用于后续药物治疗效果动态成像观察。

1.3 实验动物分组及治疗

如图1 所示，对成功构建视窗后的小鼠随机分为空白组、磷酸缓冲液组、肿瘤组以及纳米药物治疗组，每组3～4 只。其中，空白组作为对照不进行任何操作。磷酸缓冲液组在空白组的基础上第0 天进行磷酸缓冲液注射，旨在研究注射操作对视窗内毛细血管血流灌注量的影响。而肿瘤组以及纳米药物治疗组均在第0 天开始，在视窗内接种4T1 肿瘤细胞，不同的是纳米药物治疗组在第4 天开始注射纳米药物PCL-PDEM-siRNA。从第0 天到第18 天持续对各组进行活体成像。

图1 实验动物分组及治疗Fig.1 Grouping of experimental mice and the corresponding treatment strategy

1.4 肿瘤尺寸的测量方法

在DSFC肿瘤模型实验中，我们根据传统小鼠肿瘤模型的肿瘤体积计算方法：利用ImageJ软件读取明场或荧光图片上肿瘤的长（L）和宽（W），公式如下：

根据式（1）计算得到肿瘤的体积。此外，考虑到DSFC肿瘤模型中，肿瘤在垂直于视窗的方向上生长受限，且生长区域并不规则，我们也用ImageJ软件勾选出明场和荧光图像中肿瘤区域，对肿瘤的面积进行计算。

1.5 血流灌注量的计算方法

根据激光散斑成像仪拍摄出的图像，用软件自带微血管管径测量工具测量感兴趣血管的直径（D）及流速（v）。将感兴趣血管直径的软件读数（R）换算为单位μm，记放大倍数为M，计算公式如下：

根据转换得到的D值和软件读数（v）值，计算出单根血管单位时间内的灌注量即血流灌注量Q，计算公式如下［19-20］：

1.6 主要实验仪器

实验仪器主要包括：台式高速冷冻离心机（H-1850R, Eppendorf），超净工作台（SW-CJ-2FD,Airtech），共聚焦显微镜（TCS SP5 II, Leica），二氧化碳培养箱（HERAcell vios 160i, Thermo Fisher Scientific），移动式麻醉机（R520,瑞沃德），荧光分光光度计（Cary Eclipse, Aglien），超纯水仪（Milli-Q，Millipore），流式细胞仪（FACS Calibur, BD），荧光显微 镜（BX51, OLYMPUS），体视显微镜（SZX16,OLYMPUS），激光散斑成像系统（BVI, TEK SQRAY），马尔文激光粒度仪（Zetasizer-Nano-ZS-90,Malvern Panalytical）。

1.7 统计学分析

采用SPSS19.0 统计软件对数据进行统计学分析。实验组间的数据比较采用单方差分析法（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤视窗模型的构建

首先在小鼠背部构建DSFC 视窗，明场下利用体视显微镜观察视窗内是否有水肿、血管是否清晰、边缘有无出血等；然后将4T1 肿瘤细胞接种到视窗中心，观察小鼠的进食习惯及行为状态，并在接种4 d后在体视显微镜下观察接种区域局部血管形貌及新生血管情况。

结果表明，DSFC 术后小鼠状态良好，视窗不影响小鼠正常进食和行动。DSFC 构建成功30 min 后，可在体视显微镜明场下观察到视窗内血管形态，血管细长且形状规则（图2b），视窗皮下和边缘缝合区无出血无水肿，视窗中央与边缘厚度均匀。接种4T1细胞后4 d，肉眼可见接种部位隆起增厚，接种点周围直径小于20 μm 的毛细血管明显增多，血管细且弯曲（图2d），根据经验判断4T1 乳腺癌DSFC 小鼠模型已构建成功。重复实验表明，接种4T1 细胞3～5 d 后，DSFC小鼠成瘤率可达90%以上。

图2 小鼠DSFC成像Fig.2 Typical images of mouse dorsal skin-fold window chamber(DSFC)

为了连续、动态观察肿瘤及肿瘤微环境内血管的生长情况，我们利用体视显微镜对同一肿瘤小鼠视窗进行22 d连续成像。如图3所示，接种当天为第0 天，当天视窗内血管清晰，接种区域无水肿；接种第2 天可见接种区域增厚，局部毛细血管数量增加，远端毛细血管变形连接，周边大血管增粗；从第4 天到第22天，显微镜可下观察到肿瘤区域逐步增厚扩大，部分靠近接种区域的血管因与肿瘤位置重叠已无法观测，肿瘤周边的毛细血管增多、变粗。

图3 体视显微镜下第0～22天肿瘤生长变化（标尺为2 mm）Fig.3 Tumor growth observed under stereomicroscope from day 0 to day 22(Scale bar:2 mm)

2.2 肿瘤视窗活体动态成像

为了进一步研究该视窗在肿瘤药物疗效中的功能，我们选择实验室前期开发的抗肿瘤基因纳米药物PCL-PDEM-siRNA 对视窗内肿瘤进行治疗，利用荧光体视显微镜和激光散斑成像仪，对视窗内血管形态、肿瘤尺寸、血流灌注量等参数进行持续动态监测，从而研究该纳米药物的抗肿瘤特性。

首先在体视显微镜明场下观察各组实验小鼠视窗内的血管形态，并定量分析视窗内肿瘤的面积和体积，如图4 所示。图4 显示的是典型的体视显微镜明场成像结果：由图4a 可见，空白组血管形态、数量随时间延长均无明显变化；磷酸缓冲液组注射区域在第8 天出现直径900 μm 的小片阴影，且阴影区域毛细血管增多，在第12 天，阴影区域变淡减小，而毛细血管继续增多变粗。而在第16 天，阴影区域完全消失，血管形态恢复到第4 天的状态，推测是针头注射引起的短暂炎症，炎症发生在针头注射的第4～8天。

肿瘤视窗模型在接种4T1 肿瘤细胞第4 天后分为2 组，观察PCL-PDEM-siRNA 药物对肿瘤的抑制作用。由图4a后两行图像可见，与肿瘤组相比，纳米药物治疗组在第8天开始肿瘤区域停止增大，血管形态基本稳定且毛细血管的数量开始减少，也没有出现远端毛细血管连接、血管向肿瘤部位收缩的现象。为准确把握肿瘤的变化情况，我们对肿瘤组和纳米药物治疗组的肿瘤面积与体积进行定量分析。图4b是利用传统肿瘤计算公式计算得到的肿瘤体积变化趋势图，可见纳米药物治疗组在第8 天后，可以抑制肿瘤细胞生长，从而使肿瘤的尺寸维持在一定范围内不变化；考虑到DSFC 视窗模型会使肿瘤纵向生长受限，我们同时也对视窗内肿瘤面积进行计算，如图4c 所示，肿瘤面积的变化与体积变化总体趋势是相同的，纳米药物治疗组的明显肿瘤抑制效应发生在药物注射后第4天。

为避免手动划分肿瘤区域的人为误差，我们对肿瘤视窗区域进行荧光成像，利用4T1细胞转染的绿色荧光蛋白，可以清晰勾勒出肿瘤生长情况（图5）。由图5 可知，在肿瘤组接种肿瘤细胞后第4 天可观察到边界清晰的肿瘤形态；第8天肿瘤组的肿瘤尺寸持续增大，绿色的肿瘤区域内部出现黑色的管状结构为无荧光的新生血管；相对于第4天的注射纳米药物治疗组，第8 天的治疗组的肿瘤也增大，但肿瘤内部新生血管的数量明显少于肿瘤组；第12 天肿瘤组的肿瘤继续增大，肿瘤内部的新生血管数量增多且更为粗大，而纳米药物治疗组的肿瘤尺寸与第8天无显著差别，肿瘤内血管数量和形态维持稳定；第16天肿瘤组的肿瘤大小继续增大，肿瘤内部血管数量继续增加，中央细胞荧光强度明显减弱，推测中央区域发生细胞坏死；而纳米药物治疗组的肿瘤尺寸在药物注射第4天后就不再增加，肿瘤内部新生血管数量和形态无明显变化。对肿瘤区域的体积和面积的定量计算如图5b 和图5c 所示，纳米药物治疗组的肿瘤体积及面积从第8天开始趋于稳定，不再变化。该结果与荧光定性分析的结果一致，也与图4明场分析的结果一致。

图4 肿瘤生长变化图（标尺为2 mm）Fig.4 Typical stereomicroscope images and tumor growth curves(Scale bar:2 mm)

由图5可知，视窗内荧光图像的形状和明场图像的形状不完全一致。明场下肿瘤区域大多为圆形，荧光图像下则不是，而且治疗后的形状则更加不规则。此外，由于肿瘤附近和肿瘤内部的血管及血流灌注量是反应肿瘤微环境的重要指标，我们利用激光散斑成像仪，对肿瘤视窗内血流灌注量也进行了定量分析。

图5 肿瘤生长变化荧光图（标尺为2 mm）Fig.5 Fluorescence images and tumor growth curves(Scale bar:2 mm)

图6a 散斑成像可清晰分辨小鼠DSFC 区域内血流灌注量及轮廓。第4～8天，肿瘤组视野中心的信号明显变红，表明肿瘤附近区域的血流速度有了显著性提高；第8～12 天，小鼠DSFC 区域血流速度进一步加快，附近的毛细血管内血流速度也有大幅提高；第12～16 天，肿瘤区域信号颜色趋于稳定，结合图6b 定量分析可知血流灌注量依旧增大。空白组和磷酸缓冲液组的血流速度无明显波动，但磷酸缓冲液组相较于空白组血流灌注量有明显提升，考虑两方面原因：一是磷酸缓冲液的注射增加了局部体液，使血流速度加快；另一方面，可能是针头对局部的刺激造成了血流灌注量的增加。肿瘤组视窗中心（接种点附近）血流灌注量随时间明显增大。而对于纳米药物治疗组，药物注射从第4 天开始，血流灌注量相较于未治疗前略微增加，可能是由于药物注射及针头刺激引起的，在第6天之后，血流灌注量不再变化，与注射前基本一致，在第8天后，趋于稳定。

图6 小鼠DSFC激光散斑成像图（标尺为1 mm）Fig.6 Laser speckle imaging of mouse DSFC(Scale bar:1 mm)

综合以上体视显微镜的明场成像、荧光成像以及激光散斑成像数据，我们可以明确，抗肿瘤基因纳米药物PCL-PDEM-siRNA 对于4T1 乳腺癌有抑制效果，在药物注射4 d 后，肿瘤尺寸不再增大，生长被抑制，血流灌注量先升后降，纳米药物注射第6 天后与磷酸缓冲液组基本一致。

3 结论

监测肿瘤微环境对研究肿瘤发生发展的病理机制及预后具有至关重要的意义。本文通过将DSFC模型应用在乳腺癌肿瘤活体成像，将体视显微与激光散斑成像应用于肿瘤微环境的监测，旨在为抗肿瘤药物治疗研究提供一种直观、可视化的动态观测方法。本研究工作选择生长速度较快的鼠源4T1 乳腺癌细胞来构建小鼠肿瘤DSFC 模型，在裸鼠DSFC视窗内接种4T1 细胞3～5 d 后，90%以上的DSFC 小鼠可成功成瘤。利用此平台，对实验室前期合成的抗肿瘤纳米基因治疗药物PCL-PDEM-siRNA 治疗小鼠乳腺癌的过程进行活体可视化连续观察，可以监测视窗达22 d 以上。实验结果表明，视窗内肿瘤组的血流灌注量越来越大，肿瘤的体积和面积也增大，肿瘤内部新生血管增多，肿瘤周围毛细血管延长、连接、变粗；而纳米药物治疗组肿瘤的体积和面积在药物注射4 d 后不再增大，肿瘤内部新生血管数量较肿瘤组少，血流灌注量在药物治疗6 d 后趋于平稳，该研究从可视化定性和定量的角度揭示了基因治疗药物PCL-PDEM-siRNA 对小鼠乳腺癌及其微环境的作用效果。为肿瘤微环境可视化及定量化提供新的策略，对肿瘤生物学的基础研究和抗肿瘤药物研发具有重要意义。