轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中志贺杆菌的分离、鉴定及其对人克隆结肠腺癌细胞中紧密连接蛋白表达的影响

于美玲,陆恒章,陶晓莉,程美慧,李永刚,赵 微

（锦州医科大学基础医学院病原生物学实验室，辽宁 锦州 121000）

志贺杆菌（Shigella）即痢疾杆菌，是一类伴随着人类进化而出现的仅有菌毛的革兰阴性短小杆菌［1］，能够引起急性腹泻。正常肠道具有消化吸收食物及蠕动功能、免疫调节、激素分泌和黏膜屏障功 能［2］。近年来研究［3］显示：密封蛋白（Claudins）、闭合蛋白（Occludin）和闭锁小带蛋白1（zonula occludens protein-1，ZO-1）是肠上皮细胞紧密连接方式的重要组成部分，上述蛋白加强肠上皮细胞间的紧密连接，保护肠上皮细胞发挥正常功能，其中密封蛋白1（Claudin-1）最具代表性。人一旦感染致病菌，细菌将通过胃肠道黏膜到达结肠，侵袭肠上皮细胞并向相邻细胞扩散，引起胃肠黏膜屏障功能的破坏。研究［4-5］显示：大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌可以改变Claudins 和Occludin 的表达。志贺杆菌与沙门氏菌均属于肠道致病菌，志贺杆菌是否也能够通过影响紧密连接蛋白来破坏肠上皮细胞，目前尚未有文献报道。本实验采用从轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中分离鉴定的志贺杆菌侵袭Caco-2 细胞，观察志贺杆菌破坏Caco-2 细胞后紧密连接蛋白Claudin-1 和Occludin 的变化，探讨志贺杆菌破坏肠上皮细胞的机制，为肠道共生菌的功能研究奠定基础，同时也为后期辅助临床治疗志贺杆菌感染提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器

SPF 级昆明系乳鼠10 窝，雌雄不计，5 日龄，每窝7 或8 只与哺乳母鼠同笼饲养，由锦州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2019-0003，实验动物伦理学审批号：2 019014；人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2 细胞）和轮状病毒SA11 株由锦州医科大学病原生物学实验室提供；克氏双糖铁培养基（北京奥博兴生物科技有限公司），SS 培养基、志贺杆菌增菌肉汤-新生霉素和五糖发酵管（青岛海博生物公司），DMEM培养基和胎牛血清（美国Gibco 公司），一抗β-actin（中杉金桥公司），一抗Claudin-1（兔源）和一抗Occludin（鼠源）、荧光素标记羊抗兔及羊抗鼠荧光二抗（美国Invitrogen 公司），BCA 蛋白定量试剂盒（中国碧云天生物技术公司），ECL 显色液（中国Solarbio 公司）；超净工作台和恒温二氧化碳培养箱（美国NUAIRE 公司），超速台式离心机（日本Hitachi Koki 公司），酶标仪（美国Thermo公司），台式恒温摇床（中国Labotery 公司），半干转印仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 粪便样本来源

本研究使用的轮状病毒感染乳鼠粪便样本来源于实验室前期构建。将10 窝SPF 级昆明系5 日龄乳鼠进行分组：对照组乳鼠5 窝，实验组乳鼠5 窝。对照组乳鼠每天每只灌胃PBS 缓冲液100 μL，实验组乳鼠每天每只灌胃1×106CFU·mL－1的SA11株轮状病毒100 μL。乳鼠连续灌胃4 d 后收集直肠粪便，采用间接免疫荧光法（IFA）检测轮状病毒滴 度，采用实时荧光定量 PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测轮状病毒VP6 基因拷贝数。前期实验已证明乳鼠病毒灌胃4 d 后病毒滴度和病毒基因拷贝数最高，因此采集病毒感染4 d 的乳鼠粪便样本，于－80 ℃保存，用于分离志贺杆菌。

1.3 细菌分离和鉴定

采集的粪便应用PBS 缓冲液重悬稀释后接种于SS 培养皿，12 h 后挑取可疑菌落接种至志贺杆菌增菌肉汤-新生霉素液体培养基中进行增菌，37 ℃孵育10～12 h。过夜培养的菌液划线接种于SS 培养基上，37 ℃恒温培养10～12 h，观察菌落的生长情况。在SS 培养基中筛选出疑似志贺杆菌菌落，并接种于双糖铁培养基中，37 ℃培养10～12 h。将双糖铁斜面的可疑菌落接种于五糖发酵管中，37 ℃过夜培养。观察五糖发酵管的变化。同时从双糖铁培养基的斜面上筛选可疑菌落进行血清学鉴定，并进行16S rRNA 测序。鉴定后通过测定志贺杆菌的生长曲线来确定志贺杆菌的稳定期，并选择平板计数法测定此期细菌的浓度。

1.4 Caco-2 细胞的培养

－80 ℃冰箱冻存的Caco-2 细胞取出融化复苏，通过离心除去上清液，细胞再重悬于含10% FBS的DMEM 培养基中，接种于细胞培养皿中。细胞在5% CO2培养箱中37 ℃培养，待细胞生长至90%时，0.25%胰酶消化细胞，按1∶3 的比例进行传代。

1.5 细菌培养

将－80 ℃分离得到的志贺杆菌以1∶1 000 的比例加入志贺杆菌增菌肉汤-新生霉素液体培养基中，置于37 ℃摇床培养箱200 r·min－1过夜摇菌。次日8 000 r·min－1离 心10 min，PBS 缓冲液清洗2 次，用不含FBS 的DMEM 培养基将志贺杆菌梯度稀释至不同的浓度（1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU·mL－1）。

1.6 细胞存活率的测定

以每孔2×105个Caco-2 细胞接种于6 孔细胞培养板上，待细胞长至80%～90%后，将稀释好的不同浓度的志贺杆菌混合液感染Caco-2 细胞，分别处理细胞1、2、3、4、5 和6 h。将培养液轻轻吸去，并用PBS 缓冲液洗涤3 遍。将细胞用0.25%胰酶消化，用台盼蓝按9∶1 的比例染色，将混合液加入细胞计数板，观察细胞计数板：绿色即为活细胞，红色即为死细胞，并计算细胞存活率。细胞存活率=活细胞/总细胞数×100%。

1.7 志贺杆菌与Caco-2 细胞共培养模型

1.7.1 志贺杆菌与Caco-2 细胞共培养模型细菌浓度的确定 以每孔2×105个Caco-2 细胞的密度接种于6 孔细胞培养板中，待细胞生长至80%时，用稀释至不同浓度的志贺杆菌侵袭Caco-2 细胞3 h，收集细胞。参考试剂盒说明书，采用Trizol 法提取RNA，提取的RNA 用特异性引物反转录合成cDNA，－20 ℃保存。利用RT-qPCR 法对样本的DNA 模板进行扩增，反应体系按SYBR-Green-PCR 试剂盒说明书配置。每个样品重复3 个。仪器设置程序：预变性95 ℃、30 s，进入扩增循环后，95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，共扩增40 个循环，采用2－ΔΔCt法计算Claudin-1 和Occludin mRNA 的相对表达水平，确定最佳细菌浓度。ΔΔCt＝（实验组目的基因Ct 值－实验组内参基因Ct 值）－（对照组目的基因Ct 值－对照组内参基因Ct 值）。为进一步确定最佳侵袭浓度，以每孔2×105个Caco-2细胞的密度接种于6 孔细胞培养板上，方法同“1.6”以不同浓度的志贺杆菌混合液感染细胞3 h。收集细胞，加入PMSF 和NP-40 裂解液后进行裂解，上清即为总蛋白提取物。－80 ℃分装保存。按BCA 试剂盒说明书绘制标准曲线，计算浓度。将其蛋白质通过NP-40 裂解液稀释至相同的浓度，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），取每孔12 μg蛋白上样，电泳条件为80 V，浓缩凝胶运行约1 h；120 V 约1 h 运行分离胶；转膜后，5% 脱脂牛奶液封闭3 h，分别孵育一抗Claudin-1（1∶2 000）、Occludin（1∶250）和β ‑actin（1∶2 000），4 ℃过夜。PBST 洗膜5 次，每次5 min。分别加入羊抗兔二抗（1∶3 000）和羊抗鼠二抗（1∶3 000）孵育1 h，PBST 洗膜5 次，每次5 min。洗膜后，用ECL 显影剂进行曝光显影，通过Image J 软件计算目的蛋白相对β‑actin 的表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.7.2 志贺杆菌与Caco-2 细胞共培养模型侵袭时间的确定 以每孔2×105个Caco-2 细胞的密度接种于6 孔细胞培养板中，待细胞生长至80%时，用稀释至最佳浓度的志贺杆菌处理Caco-2 细胞1、2、3、4、5 和6 h，收集细胞，提取RNA，通过VP6特异性引物反转录cDNA，方法“1.7.1”利用RT-qPCR 法对样本的DNA 模板进行扩增，采用2－ΔΔCT法计算Claudin-1 和Occludin mRNA 的相对表达水平。以每孔2×105个Caco-2 细胞的密度接种于6 孔细胞培养板中，待细胞生长至80% 时，用稀释至最佳浓度的志贺杆菌处理Caco-2 细胞1、2、3、4、5 和6 h，收集细胞，用PMSF 和NP-40裂解提取蛋白。方法同“1.7.1”测定蛋白浓度进行Western blotting 法检测，计算目的蛋白表达水平。

1.8 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。采用GraphPad Prism 8 软件绘图。各组细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 及蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 志贺杆菌的鉴定及生长曲线

菌落在SS 琼脂培养基上生长状态良好，且呈现圆形、无色、微凸、半透明和边缘较齐的形态，直径为0.5～2.0 μm，在36 h 内为无色菌落，36 h后菌落呈现红色，见图1A。对乳鼠粪便分离得到的细菌进行生化鉴定，观察到双糖铁培养基斜面不变色，底部为黄色，并且穿刺线明显，疑似致病性肠道菌。该菌对乳糖呈阴性，对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇呈阳性。在血清玻片凝集试验中，载玻片上出现的沙粒状或片状即为志贺杆菌。

将分离株的16S rRNA 序列（将其标记为Shigella）与志贺杆菌的16S rRNA 序列进行比较，结果表明：该菌株与志贺杆菌16S rRNA 序列同源性为99%。为了进一步验证，将变形杆菌（Proteus）作为一个外属，在MEGA7 软件中采用NJ 法对分离菌株的16S rRNA 序列进行了分析，结果表明：分离株与志贺杆菌16S rRNA 基因同源性为99%，确定为志贺杆菌。见图1B。

图1 志贺杆菌的分离和鉴定Fig.1 Isolation and identification of Shigella

志贺杆菌的生长曲线见图2，横坐标为培养时间，纵坐标为吸光度［A（600）］值。志贺杆菌在3 h 前达到迟缓 期；3～8 h 志贺杆菌A（600）值迅速上升，处于对数生长期；12～24 h 曲线趋于平缓，达到稳定期。因此在后期实验中，均采取培养12 h 的志贺杆菌与Caco-2 细胞进行共培养。采用平板计数法测定志贺杆菌浓度为1.7×109CFU·mL－1。

图2 志贺杆菌生长曲线Fig.2 Growth curve of Shigella

2.2 不同浓度志贺杆菌感染不同时间Caco-2 细胞的存活率

采用不同浓度梯度稀释的志贺杆菌混合液（1×105、1×106、1×107和1×108CFU·mL－1）分别对Caco-2 细胞进行不同时间的处理，当不同浓度的志贺杆菌侵袭时间≤4 h 时，2 组Caco-2 细胞存活率比较差异无统计学意义（P＞0.05），各组细胞存活率均达80% 以上。当侵袭时间延长至5 h时，与对照组比较，浓度为1×106和1×108CFU·mL－1的志贺杆菌细胞存活率明显下降（P＜0.05），因此初步确认志贺杆菌侵袭时间为4 h内，见表1。

表1 不同浓度志贺杆菌感染不同时间Caco-2 细胞存活率Tab.1 Survival rates of Caco-2 cells after infected different concentrations of Shigella for different time（n=3,,η/%）

表1 不同浓度志贺杆菌感染不同时间Caco-2 细胞存活率Tab.1 Survival rates of Caco-2 cells after infected different concentrations of Shigella for different time（n=3,,η/%）

*P＜0.05 compared with control group.

2.3 志贺杆菌与Caco-2 细胞共培养模型

2.3.1 不同侵袭时间志贺杆菌与Caco-2 细胞共培养后Claudin-1 和Occludin mRNA 及蛋白表达水平 图3A 和3B 所示为不同浓度的志贺杆菌侵袭3 h时细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 表达水平。与对照组比较，当志贺杆菌浓度为1×106CFU·mL－1侵袭3 h 时，Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01），随着志贺杆菌浓度的升高进行侵袭时，细胞中Claudin-1 仅有微弱下降（P＜0.05）。图4、图5A 和5B 所示为不同浓度的志贺杆菌侵袭3 h 时Claudin-1 和Occludin 蛋白表达水平，当细菌浓度为1×106CFU·mL－1侵袭3 h 时，细胞 中Claudin-1 和Occludin 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），随着细菌浓度的升高，细胞中Claudin-1 和Occludin蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

图3 各组Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 表达水平Fig.3 Expression levels of Claudin-1 and Occludin mRNA in Caco-2 cells in various groups

图4 不同浓度志贺杆菌感染后各组Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin 蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of Claudin-1 and Occludin proteins in cells in various groups after infected with different concentrations of Shigella for different time

2.3.2 志贺杆菌侵袭不同时间Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin 表达水平 图3C 和3D 所示为1×106CFU·mL－1志贺杆菌侵袭不同时间Caco-2细胞中mRNA 表达水平。与对照组比较，当侵袭3 h 时，细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 表达水平开始明显下降（P＜0.05）。与对照组比较，侵袭时间为4、5 和6 h，细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 表达水平均下降（P＜0.05 或P＜0.01）。图5C、图5D 和图6 所示为1×106CFU·mL－1志贺杆菌侵袭不同时间Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin 蛋白表达水平，与对照组比较，侵袭时间在1～6 h 时，细胞中Claudin-1 和Occludin 蛋白表达水平均明显下降（P＜0.01）。侵袭6 h 细胞中Occludin 蛋白表达水平下降最明显，其次为侵袭3 h 时。

图5 各组Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin 蛋白表达水平Fig.5 Expression levels of Claudin-1 and Occludin in Caco-2 cells in various groups

图6 志贺杆菌感染不同时间后各组Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin 蛋白表达电泳图Fig.6 Electrophoregram of expressions of Claudin-1 and Occludin proteins in Caco-2 cells in various groups after infected with Shigella for different time

3 讨论

当细菌侵袭肠上皮细胞时，细菌颗粒与待侵入的细胞膜表面上的一些脂质紧密结合，在细胞膜上形成簇，从而导致细胞膜内陷弯曲，细菌毒素通过此内陷结构进入肠上皮细胞［6］。细菌一旦进入便开始改变细胞的遗传机制，感染也从此开始，肠上皮细胞也将发生一系列的变化。紧密连接蛋白Occludin、Claudins 和ZOs 的完整表达及其相互结合是确保肠上皮细胞膜屏障功能的先决条件。但紧密连接受损后，肠上皮细胞的黏膜通透性增加，肠上皮细胞的屏障功能受损。当各菌群的数量和比例发生明显变化时，肠上皮细胞的黏膜屏障将会发生改变，如双歧杆菌［7-8］和乳酸杆菌［9-10］等益生菌可以增加紧密连接蛋白的表达量，沙门菌属和大肠杆菌等致病菌可以降低紧密连接蛋白的表达量［4］。张汉运等［11］以HT-29 细胞为模型发现：EHEC O157∶H7可以破坏紧密连接蛋白Occludin、Claudins 和Zos，从而破坏肠道的屏障功能。而乳酸菌HM0539可以预防EHEC O157∶H7的侵袭和破坏，进而保护肠上皮的屏障功能，YU 等［12］通过EHEC O157∶H7感染Caco-2 细胞也证实了此观点；KESSLER 等［5］采用体外提取透明质酸研究其对沙门氏菌感染的影响，发现沙门氏菌可以降低Claudin-1 的表达，透明质酸可以减少沙门氏菌的感染；也有研究［13-14］显示：老鼠灌喂EHEC后Occludin、Claudins 和Zos 的表达水平降低，肠黏膜的通透性升高；白色念珠菌等真菌可以导致上皮细胞和屏障功能的破坏。志贺杆菌作为强毒肠道细菌之一，其发病机制是基于细菌在结肠上皮内入侵和复制的能力，这可能导致严重的肠道炎症反应和肠上皮细胞的破坏［15］。1964 年，LABREC 等［16］发现痢疾志贺杆菌感染后发生腹泻与肠上皮细胞的渗透密切相关。但是目前尚未有文献报道志贺杆菌侵袭肠上皮细胞时对Occludin 和Claudin-1 表达的影响。

Caco-2 细胞为人结肠癌细胞，其结构和功能与分化的小肠上皮细胞相似；其次，Caco-2 细胞能够在体外良好培养，当细胞达到融合状态时可以表现出类似肠上皮细胞的形态特征［17-18］，因此本研究采用Caco-2 细胞进行实验。本研究以前期的研究为基础，通过对灌喂轮状病毒乳鼠的粪便进行16S DNA 测序发现病毒感染组较对照组志贺杆菌明显增加。因此在此基础上经过16S rRNA 分析和血清学鉴定确定为志贺杆菌属，通过志贺杆菌的生长曲线，得到志贺杆菌生长的平台期，并确定后期实验的志贺杆菌浓度。为确保Caco-2 细胞存活率一致，将扩大培养后的志贺杆菌通过不同浓度梯度稀释以及感染不同时间来侵袭Caco-2 细胞，以细胞存活率作为评价指标，初步判断志贺杆菌侵袭时间在4 h 之 内，与FERNANDEZ-DUARTE 等［19］在 体外实验中发现宋内志贺杆菌侵袭Caco-2 细胞4 h后，细胞活力明显下降的结论相符。采用RTqPCR 法和Western blotting 法等实验检测Caco-2 细胞中Claudin-1 和Occludin mRNA 及蛋白表达水平，结果显示：在不影响细胞存活率的前提下，志贺杆菌浓度为1×106CFU·mL－1、侵袭时间为3 h 时，细胞内Claudin-1 和Occludin 表达水平开始发生明显下降，志贺杆菌能够破坏Occludin 和Claudins 的正常表达。

综上所述，志贺杆菌可能与沙门氏菌［5］相似，通过破坏紧密连接蛋白Claudins 和Occludin 等来破坏肠道黏膜上皮的机械屏障，从而影响肠上皮细胞屏障的正常功能。近年来越来越多的研究［20-21］显示：肠道细菌和轮状病毒之间的相互影响，本课题组推测志贺杆菌与轮状病毒间可能存在相互影响，前期通过建立轮状病毒感染乳鼠模型，筛选到10 个差异性菌属，其中志贺杆菌在轮状病毒感染乳鼠体内的丰度最高，因此本实验从轮状病毒感染乳鼠后的粪便中分离志贺杆菌。本课题组后续将进一步深入研究志贺氏杆菌与轮状病毒在肠道内的相互作用关系，从而为深入探讨志贺氏杆菌与轮状病毒合并感染及肠道微环境的变化奠定基础。