鹿茸多肽对轻度认知功能障碍大鼠学习记忆能力的改善作用及其调节Keap1/Nrf2/HO-1 信号通路的机制

黄晓巍 ,刘玥欣 ,王晋冀 ,许佳明 ,唐秋竹 ,林 贺 ,任吉祥,兰天野

（1.长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学药学院实验实训中心，吉林 长春 130117；3.长春中医药大学创新实践中心药品检验实训教研室，吉林 长春 130117；4.长春中医药大学附属医院治未病中心，吉林 长春 130021；5.长春中医药大学附属医院脑病中心，吉林 长春 130021）

轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）是正常人体转变为阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的过渡阶段，由于AD 是不可逆转的，因此对MCI 进行早期干预，对于降低AD 的发病率具有重要意义［1-4］。花鹿茸为梅花鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，是吉林省的道地药材，鹿茸具有壮肾阳和益精血等功效［5］。VAP（velvet antler polypeptide，VAP）是鹿茸的主要有效成分之一，包含多种生长因子，具有良好的药理作用和保健功效［6］。研究［7］表明：MCI 的发生常与机体氧化应激反应相关。KELCH 状ECH相关蛋白 1（KELCH-like ECH-associated protein 1，Keap1）、核因子E2 相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）和血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是Keap1/Nrf2/HO-1氧化应激信号通路上的相关作用靶点［8］，而VAP具有抗氧化应激作用，但其是否通过Keap1/Nrf2/HO-1 信号通路改善MCI 有待进一步研究［9］。本研究采用腹腔中注射东莨菪碱的方法诱导制备MCI大鼠模型，通过观察VAP 对模型大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平的影响，探讨其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、主要试剂和仪器Wistar 清洁级大鼠50 只，体质量（200±20）g，雌雄各半，购于亿斯实验动物技术有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK-（吉）-2018-0007；梅花鹿鹿茸（珍源鹿业有限公司，批号：20180325），VAP（长春中医药大学药学院制备，每1 g 约含生药28.7 g），吡拉西坦片（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：6190901），东莨菪碱（阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：D172511B），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平检测试剂盒（酶免实业有限公司，批号：MM-0386R1、MM-0385R1），Keap1、Nrf2、GAPDH 一抗和HRP 二抗（北京索莱宝科技有限公司，批号：K106685P、K008925P、K200057M和10494-1-AP），彩虹245 广谱蛋白Marker、全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL 化学发光法检测试剂盒和凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：PR1920、BC3711、PC0020、SW2010和P1200-2）；Morris 水迷宫及行为学分析系统（泰盟科技有限公司，型号：WMT-100S），组织包埋机（泰维科技实业有限公司，型号：TB-718D），显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：CKX41），酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Multiskan FC），电泳仪、电泳系统和转印槽（美国Bio-Rad公司，型号：BE6085），荧光发光凝胶成像仪（瑞士Tecan 公司，型号：Alliance Q9），4 ℃低温离心机（德国艾本德股份公司，型号：Centrifuge 5810R），－80 ℃超低温冰箱（美国赛默飞世尔科技公司，型号：ULT1386-3-V41）。

1.2 实验动物分组、给药和造模将50 只大鼠随机分为正常对照组、MCI 组、吡拉西坦组、低剂量VAP 组和高剂量VAP 组。正常对照组和MCI 组大鼠灌胃等体积生理盐水，吡拉西坦组大鼠灌胃500 mg·kg－1吡拉西坦，低剂量VAP 组大鼠灌胃200 mg·kg－1VAP，高剂量VAP 组大鼠灌胃300 mg·kg－1VAP 。动物造模时除正常对照组外其他组在灌胃给药18 d 后2 h 腹腔中注射东莨菪碱2 mg·kg－1。

1.3 Morris 水迷宫实验于给药第11～17 天给药2 h 后进行适应性实验，将动物任意位置放入水迷宫，明确动物逃避潜伏期、行为路径、穿过平台位置次数和有效区停留时间，适应性实验中，如动物在水迷宫中时间超过60 s，则引导动物到达平台，并让动物在平台上停留10 s。于给药第18 天给药2 h 后进行正式实验，记录各组动物逃避潜伏期、行为路径、穿过平台位置次数和有效区停留时间。结束后，采用3%戊巴比妥钠（35 mg·kg－1）对各组大鼠进行麻醉，用无菌注射器在腹部主动脉进行取血8 mL，4 000 r·min－1离心8 min，吸取上层血清，－80 ℃密封保存，用于后续ELISA 法检测；处死各组大鼠，摘取大鼠脑组织，分离出海马区，分别放于含4%组织固定液的瓶中，于4 ℃避光保存，用于后续HE 染色。其中部分组织于－80 ℃保存，用于后续Western blotting 法分析。

1.4 大鼠海马组织HE 染色大鼠海马组织进行脱水处理后，利用软蜡进行包埋，冷冻后切片，厚度7 μm，染液处理完成后，显微镜观察各组大鼠海马组织的细胞形态表现。

1.5 ELISA 法测定各组大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平依照检测试剂盒具体要求进行操作，检测各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平。

1.6 Western blotting 法检测各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平提取大鼠海马组织总蛋白后定量至浓度为2 g·L－1；在蛋白样品中按比例放入2 倍样品缓冲液并充分混合，100 ℃中密闭放置加热5 min，待降至室温时，备用。制备10% SDS-PAGE 凝胶电泳，每孔20 μL 上样，100 V 恒定电流转至PADF 膜60 min，脱脂奶粉封闭2 h，洗膜，加入适宜浓度的Keap1、Nrf2 和HO-1 抗体，4 ℃条件下孵育24 h，清洗后加入二抗（1∶2 000，选用5%脱脂奶粉稀释），封闭液中浸泡2 h，显色剂处理后，荧光发光凝胶成像仪中进行定影，测定蛋白条带的灰度值。采用Image J 图像处理软件对蛋白条带进行分析。

1.7 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。水迷宫实验中各组大鼠逃避潜伏期、行为路径、穿过平台位置次数和有效区停留时间，血清中SOD 活性和MDA 水平，大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris 水迷宫实验检测指标与正常对照组比较，MCI 组大鼠逃避潜伏期和行为路径明显升高（P＜0.01），穿过平台位置次数和有效区停留时间明显降低（P＜0.01）。与MCI 组比较，吡拉西坦组、低剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠逃避潜伏期明显降低（P＜0.01），吡拉西坦组和高剂量VAP 组大鼠行为路径明显缩短（P＜0.01），吡拉西坦组、低剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠穿过平台位置次数和有效区停留时间明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠Morris 水迷宫实验结果Tab.1 Results of Morris water maze test of rats in various groups (n=10,)

表1 各组大鼠Morris 水迷宫实验结果Tab.1 Results of Morris water maze test of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs MCI group.

2.2 各组大鼠海马组织HE 染色结果正常对照组大鼠海马组织中细胞形态相对完整，且排列有序。MCI 组大鼠海马组织中细胞数量明显减少，且排列方式和正常对照组相比由有序变为相对混乱。吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠海马组织中的细胞排列较MCI组相对整齐，形态也略规则。见图1。

图1 各组大鼠海马组织HE 染色结果（×200）Fig.1 HE staining results of hippocampus tissue of rats in various groups（×200）

2.3 各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平与正常对照组比较，MCI 组大鼠血清中SOD 活性明显降低（P＜0.01），MDA 水平明显升高（P＜0.01）；与MCI 组比较，吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠血清中SOD 活性明显升高（P＜0.01），MDA 水平明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平Tab.2 SOD activities and MDA levels in serum of rats in various groups (n=10,)

表2 各组大鼠血清中SOD 活性和MDA 水平Tab.2 SOD activities and MDA levels in serum of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs MCI group.

2.4 各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平与正常对照组比较，MCI 组大鼠海马组织中Keap1蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与MCI 组比较，吡拉西坦组、低剂量VAP 组和高剂量VAP 组大鼠海马组织中Keap1 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），Nrf2和HO-1蛋白表达水平均有明显升高（P＜0.01）。见图2 和表3。

表3 各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of Keap1,Nrf2,and NO-1 in hippocampus tissue of rats in various groups (n=10,)

表3 各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of Keap1,Nrf2,and NO-1 in hippocampus tissue of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs MCI group.

图2 各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of Keap1,Nrf2,and NO-1 proteins in hippocampus tissue of rats in various groups

3 讨论

由于我国人口呈老龄化趋势，与其相关疾病引起广泛关注。MCI 被认为是易患AD 的高风险人群，故正确认识MCI 并尽早对MCI 进行干预，能更好地防止AD 发生［10］。Keap1/Nrf2/HO-1 信 号通路是经典的抗氧化应激信号通路，在人体中发挥抗氧化反应的关键作用。MCI 的产生与机体内的氧化应激反应有密切关联［8］。

本实验中采用的造模药物为东莨菪碱，其为中枢神经系统抑制剂，可通过在毒蕈碱乙酰胆碱受体充当竞争性拮抗剂发挥其效用，从而造成相应病理变化。胆碱能活动在记忆和认知功能中起重要作用，研究［11-13］表明：胆碱能活性下降会导致相关递质含量下降，致使MCI 患者大脑中的海马组织等胆碱能神经元受损明显。故本研究采用此方法进行造模。本研究结果表明：VAP 能够抑制模型大鼠海马组织中Keap1 表达、促进Nrf2 和HO-1 表达。在氧化应激下，Keap1/Nrf2 生成停止，Nrf2移位胞核，然后通过巨噬细胞活化因子形成异源二聚体，与靶基因内的抗氧化反应元件进行点位结合［14-16］。进一步调节Ⅱ相解毒酶等靶基因相关活性，从而将ROS 等有害物质加以清除。HO-1 是Ⅱ相解毒酶之一，此蛋白引起的下级反应能够保护多种脏腑器官，避免其出现氧化应激现象［17-19］；VAP 可通过调节模型大鼠体内Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，产生抗氧化应激作用，增加SOD活性，抑制MDA产生。降低MDA水平能够减少蛋白质及核酸等物质间的交联聚合现象，降低细胞的毒性伤害。SOD属于抗氧化金属酶之一，具有对超氧阴离子自由基歧化的催化作用，从而可以生成氧和过氧化氢。当抗氧化应激作用产生后，机体会抑制MDA 水平升高，促进SOD 生成，从而抵抗氧化应激损伤［20］。本研究结果显示：VAP 能够增强由东莨菪碱引起的MCI 实验模型大鼠学习和记忆能力，增加大鼠体内SOD 活性，同时减少MDA 产生，提高大鼠海马组织中Nrf2 和HO-1 表达，抑制Keap1 表达，提示VAP 改善MCI 模型大鼠的作用机制可能与调节Keap1/Nrf2/HO-1 信号通路有关。