辣椒细菌性果实条斑病菌生物学特性及抑菌药剂筛选
2021-10-14张卢慧赵志强赵全新郭庆元
张卢慧，赵志强，赵全新，郭庆元
（新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052）
0 引言
辣椒(Capsicum annuum)是全球第一大蔬菜，是世界上种植面积最大的蔬菜作物之一[1-2]。在世界辣椒种植的范围内，中国在辣椒的生产与出口上均占据首位[3-4]。由于辣椒对外界环境的适应性强、品种多、种植面积大且收益多，所以辣椒的种植不仅帮助农民增收致富，同时也成为了农村发展的重要支柱产业，促进了农村经济的发展[5]。随着辣椒种植面积的扩大，发生在辣椒上的病害逐渐增加，严重制约着辣椒的品质及产量。文献已报道的辣椒病害主要有辣椒病毒病[6]、辣椒真菌性病害[7-8]以及辣椒细菌性病害[9-10]，其中辣椒细菌性病害主要有细菌性疮痂病、细菌性叶斑病、软腐病、溃疡病、青枯病[11-15]，这些病害对辣椒的生产造成了很大的影响。针对以上报道的辣椒病害，国内外研究人员对其病原鉴定、发病规律、防治方法等均进行了深入的研究[16-18]，为辣椒病害的防治起到了很好的作用。
新疆作为国内辣椒产业的一支新军，近年来发展速度非常快[19]，2018年，笔者在新疆巴州和硕县辣椒种植区内发现一种新的辣椒细菌性果实条斑病病害，该病害主要侵染辣椒果实、叶柄及嫩茎，以果实病斑最为显著，叶片无明显症状，发病的辣椒果实表面布有褐色的条形病斑，据调查，该病害在当地辣椒生产中发生普遍，是危害最大的病害，该病害的发病症状与国内外已报道的辣椒细菌性病害及辣椒条斑病毒病不同，是一种国内新发现病害。在前期的工作中，笔者对该病害的病原菌进行了鉴定，病原菌鉴定为阿根廷假单胞菌(P.argentinensis)，而关于该病害的发病规律及防治等未开展相关的研究，因此笔者针对病原菌的生物学特性及药剂筛选开展研究，以期为田间病害规律研究和病害防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 从新疆巴州和硕县辣椒种植区采集的辣椒细菌性条斑病病样，对病样采用组织分离、烟草过敏性反应、致病性回接测定、形态学观察、生理生化测定、16S rDNA分子鉴定，严格鉴定并保存好的致病菌株阿根廷假单胞菌菌株KHL-1。
1.1.2 供试药剂 查阅文献上报道的细菌杀菌剂[20-22]，同时结合市场上的细菌性杀菌剂，选择18种供试细菌杀菌剂（表1）。
表1 18种供试杀菌剂药剂类型
1.2 辣椒细菌性条斑病病原菌生物学特性测定
1.2.1 病原菌的活化与接种液的制备 将病原菌平板划线于NA固体培养基平板上，28℃活化培养48 h后，挑取培养基表面长出的单菌落转接到NA培养液中，28℃、160 r/min过夜振荡培养12 h，用紫外分光计测定菌液的OD600值，至OD600值为1.0～1.2左右时作为接种液用。
1.2.2 温度对病原菌生长的影响 将制备好的NA培养液分装到试管中，每个试管中分装10 mL NA培养液，按照1.2.1的方法制备接种液，每个分装的试管中分别加入0.1 mL的接种液。将接种后的试管分别置于温度为0、5、10、15、20、25、28、30、35、40℃的ZWY-2102C全温型多振幅轨道摇床上，160 r/min振荡培养48 h，每组温度设置3个重复，以不接菌培养液为对照，振荡培养48 h后，在紫外分光光度计下测定并记录菌液在不同温度下的OD600值。
1.2.3 pH对病原菌生长的影响 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液将NA培养液的pH分别调整为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。按照1.2.2的方法接种病原菌，每组处理设3个重复，以不接菌培养液为对照，将摇床设置成28℃、160 r/min，振荡培养48 h。在摇床振荡培养48 h后，在紫外分光光度计下测定并记录菌液在不同pH下的OD600值。
1.2.4 NaCl浓度对病原菌生长的影响 以不加NaCl的NA培养液为基础，将NA培养液中NaCl浓度分别配制成0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%。按照1.2.2的方法接种病原菌，每个NaCl浓度设3次重复，以不接菌培养液为对照，将摇床设置成28℃、160 r/min，振荡培养48 h。在摇床振荡培养48 h后，在紫外分光光度计下测定并记录菌液在不同NaCl浓度下的OD600值。
1.3 室内药剂毒力筛选试验
采用滤纸片抑菌圈法进行测定[23]，参考王璐瑶等[24]报道的室内药剂毒力筛选试验，试验分为2步进行，（1）按照田间推荐使用浓度将18种供试药剂按有效成分用无菌水配制成5个浓度进行初筛试验，每个浓度3个重复，以无菌水为对照。先用移液枪吸取用无菌水稀释至106的菌悬液100μL，用涂布棒均匀地涂布在NA平板上，涂完后将平板静置，待涂有菌的培养基表面干燥。用镊子夹取直径6 mm灭过菌的滤纸片，放入配制好的药液中吸附1 min，再用镊子将浸泡过药剂的滤纸片取出，由于取出的滤纸片上吸附的药剂过多，将滤纸片放在三角瓶瓶口壁上使多余的药剂滴落，再用镊子夹取滤纸片等距离的放置在NA平板上，每皿放置3片滤纸片，将平板置于28℃培养箱中培养24 h，采用十字交叉法测量不同药剂在不同浓度下病原菌的抑菌圈大小。（2）将初筛中有抑菌效果的药剂进行室内毒力测定试验，以药剂浓度的对数为自变量，抑菌圈的平均直径为因变量，求出毒力回归方程[25]，比较不同药剂的EC50值。
1.4 数据分析
用SPSS 26.0软件对试验数据进行分析，比较各处理间的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 温度对病原菌生长的影响
由图1可以得出，病原菌在培养的温度5～40℃内均能够生长，病原菌的最适生长温度为28℃。当病原菌培养的温度在5℃以下时，病原菌的生长受到抑制。
图1 病原菌在不同温度下的生长情况
2.2 酸碱度对病原菌生长的影响
由图2可以得出，病原菌在培养液的pH 5.0～11.0时均能够生长，培养液pH 7最适宜病原菌的生长。培养液pH 6时紫外分光光度计下测得的菌液OD600值为1.074，而当培养液pH 8时紫外分光光度计下菌液OD600值0.797，说明菌体适宜在中性偏酸的环境中生长。当培养液pH 5.0以下、pH 11.0以上时，病原菌的生长停滞，病原菌的生长受到抑制。
图2 病原菌在不同pH下的生长情况
2.3 盐浓度对病原菌生长的影响
由图3可以得出，病原菌的耐盐性范围为0%～12%，在该范围内病原菌能够生长。当培养液中的NaCl浓度为2%时，能够促进病原菌的生长。当培养液中的NaCl浓度超过12%时，病原菌的生长停滞，病原菌的生长受到抑制。
图3 耐盐性测定
2.4 供试药剂室内抑菌测定结果
由表2可以看出，供试的18种细菌杀菌剂在制剂推荐使用浓度范围内，不同的药剂对病原菌的抑制效果不同。18种供试药剂中，四霉素、乙蒜素、氯溴异氰尿酸、77%志信在制剂推荐使用浓度范围内设置的5个浓度下对病原菌均有抑制作用。2%春雷霉素仅在药剂浓度为50、100 mg/L对病原菌有抑制作用，20%乙酸铜仅在药剂浓度为10000 mg/L时对病原菌有抑制作用，在其余的浓度下无抑菌效果。其余的12种供试药剂在田间推荐使用浓度范围内设置的5个浓度对病原菌均无抑菌作用。
表2 18种杀菌剂在不同浓度下对辣椒细菌性果实条斑病菌抑制作用
由于只有四霉素、乙蒜素、氯溴异氰尿酸、77%志信这4种药剂在田间推荐使用浓度范围内设置的5个浓度均对病原菌有抑制效果，因此以这4种药剂供试的药剂浓度的对数为自变量，抑菌圈平均直径为因变量，得到毒力回归方程及EC50。
4种供试药剂室内毒力测定结果（表3）表明，四霉素、乙蒜素、77%志信、氯溴异氰尿酸4种药剂的EC50值分别为11.75、340.95、994.36、1464.71 mg/L，其中以四霉素的毒力最强，高于其余3种药剂。
表3 4种杀菌剂室内毒力测定结果
续表2
3 结论与讨论
辣椒细菌性果实条斑病是发生在新疆巴州和硕县辣椒种植区的一种新病害，其病原菌为阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)，由于该病害是一种新病害，国内对于该病害的研究尚未有相关文献的报道，为了给田间病害规律研究和病害防治提供理论依据基础，本研究在前期病原菌准确鉴定的基础上，对病原菌开展生物学特性及药剂筛选试验。对病原菌的部分生物学特性进行测定，结果表明病原菌在外界环境温度为5～40℃范围内均能生长，最适宜生长温度范围为25～35℃，6月为该病害高发期。病原菌在pH 5.0～11.0范围内均能生长，菌体适宜在中性偏酸的环境中生长，最适pH 7.0，当pH 5.0以下、pH 11.0以上时，病原菌的生长停滞。病原菌在NaCl浓度为0%～12%范围内均可以生长，其中以2%的NaCl浓度促进病原菌的生长，病原菌的耐盐性为12%。
续表3
在病原菌的室内药剂筛选试验中，供试的18种细菌杀菌剂在田间推荐使用浓度下，四霉素、乙蒜素、氯溴异氰尿酸、77%志信在田间推荐使用浓度范围内设置的5个浓度下对病原菌均有抑制作用，2%春雷霉素在药剂浓度为50、100 mg/L对病原菌有抑制作用，20%乙酸铜仅在药剂浓度为10000 mg/L时对病原菌有抑制作用，其余的12种供试药剂在田间推荐使用浓度范围内设置的5个浓度下对病原菌均无抑菌作用。毒力测定结果表明四霉素的毒力较强，EC50值为11.75 mg/L，毒力强于其他药剂，可作为防治的首选。由于本试验毒力测定结果仅是室内平板筛选出的结果，不同的药剂作用在植物上的机理不同，其对病害的防效也不同，因此在室内筛选出的具有抑菌作用的药剂，还需进一步试验确定其防治效果及用于防治的最适浓度，为田间病害防治提供防治基础。
