香瓜根结线虫种类鉴定及杀线剂的室内毒力测定

李周容，孙燕芳，陈 园，裴月令，冯推紫，龙海波

（1. 海南大学 植物保护学院，海口，570228; 2. 中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所，海口，571101）

西甜瓜（西瓜、哈密瓜、香瓜等）是海南热带特色高效农业的“王牌”产业，2020年海南种植面积近333 333.33 hm−2，年产值约100亿元[1]。其中，冬春季种植的薄皮甜瓜年均播种面积3 000～4 000 hm−2，因栽培周期短、上市早、经济效益好，已成为当地农民增收的主要产业之一[2]。近年来，随着种植年限的增加和重茬连作，由根结线虫（Meloidogynespp.）引起的根结线虫病已成为海南西甜瓜生产上的一种主要根部病害，尤其在乐东、东方、三亚的设施大棚甜瓜种植上普遍发生，一般可导致20%～30%产量损失，严重时产量损失在50%以上甚至绝收[3−4]。由于缺乏有效的抗病品种，生产上主要依赖化学杀线剂防治西甜瓜根结线虫病害。目前，市场上应用较普遍的有阿维菌素、噻唑膦和氟吡菌酰胺等少数非熏蒸性类杀线剂。西甜瓜根结线虫病病原发生种类较多，孔祥义等[5]报道大棚甜瓜根结线虫病病原有南方根结线虫（M. incognita）、花生根结线虫（M. arenaria）和北方根结线虫（M. hapla）。龙海波等[6]鉴定危害海南哈密瓜上的甜瓜根结线虫病病原的主要种类有南方根结线虫（M. incognita）、爪哇根结线虫（M. javanica）和象耳豆根结线虫（M. enterolobii）；张国锋等[7]报道了南方根结线虫（M. incognita）是危害西瓜根结线虫的优势种群。在对海南西甜瓜线虫病害的调查过程中，笔者发现根结线虫侵染危害露地栽培香瓜（Cucumis meloL. var. makuwa cv. ‘Silver Light’）。本研究采用形态和分子鉴定对采集的根结线虫进行种类鉴定，同时筛选了几种常用的杀线剂品种，分析测定其对采集的海南香瓜根结线虫种群的毒力，旨在为高效防控田间根结线虫病害提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试病样于2019年在海南省文昌市乌鸡塘村采集到具有明显“根结”症状的香瓜病根。从香瓜病根挑取饱满的单卵囊接种至长丰3号辣椒上进行保种、繁殖及纯化培养。

1.2 供试药剂及配制浓度将供试原药用丙酮配制成母液，再用0.1%的吐温80水溶液配制成5个浓度（表1）。

表1 药剂及其浓度Tab. 1 Nematicides and their concentrations

1.3 试验方法

1.3.1 根结线虫形态鉴定直接挑取香瓜根系上的卵囊孵化得到2龄幼虫，用挑针从病根组织中分离获得雌虫。参照刘维志[8]所描述的方法进行观察，测量并记录2龄幼虫体长，最大体宽，口针长度，尾长等形态指标。2龄幼虫的观察样本数为20头。参照张绍升[9]所描述的方法制作雌虫会阴花纹永久玻片，在显微镜下观察并拍照。

1.3.2 根结线虫DNA提取根据1.3方法得到2龄幼虫悬浮液，参照龙海波等[6]的方法，挑取单头2龄幼虫进行DNA提取并于−20 ℃保存备用。

1.3.3 rDNA-ITS序列扩增利用万新龙等[10]设计的引物V5367 (TTGATTACGTCCCTGCCCTTT)和26s (TTTCACTCGCCGTTACTAAGG) 扩增根结线虫ITS序列。PCR反应使用ExTaq酶PCR扩增试剂盒（TaKaRa），扩增体系参照龙海波等[6]的方法。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测观察，并对目的条带进行切胶回收、连接、转化，最后挑取阳性克隆送至广州华大基因科技有限公司测序，将获得的线虫rDNA-ITS区序列与GenBank数据库中根结线虫序列进行比对分析。

1.3.4 线虫SCAR标记特异性引物检测利用LONG等[11]设计的象耳豆根结线虫SCAR标记的特异引物MeF (AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG) 和MeR (TCAGTTCAGGCAGGATCAACC) 进行扩增。PCR扩增、产物电泳检测方法同1.5。

1.3.5 药剂毒力的测定采用浸渍法，将1.3方法中得到的2龄幼虫悬浮液调制为400条·mL−1备用。取24孔细胞培养板，每孔加入1 mL配制好的各浓度药剂，分别加入1 mL根结线虫2龄幼虫悬浮液，以0.1%的吐温80水溶液做空白对照，每个浓度重复4次。将药剂处理的2龄幼虫悬浮液于28 ℃培养箱中放置24 h后，将每处理中的加药线虫悬浮液转移至生物计数板中，显微镜下观察，活的线虫虫体呈现有弧度的弯曲，而死亡的线虫身体僵直（图1），10 min内完成统计。

图1 显微镜下活的及死亡的象耳豆根结线虫2龄幼虫Fig. 1 The live and dead second instar larvae of M.enterolobii under microscope

1.3.6 数据统计使用Excel、SPSS对数据进行分析处理，计算各处理的死亡率和校正死亡率，并用机率值分析法计算出各个药剂的致死中浓度LC50值和95%置信区间。

2 结果与分析

2.1 形态特征2龄幼虫和雌虫会阴花纹的显微观察：2龄幼虫呈线形，体环小、头冠明显、侧唇大呈三角形；口针纤细，基部球大且圆，与口针基杆分界明显；中食道球呈椭圆形，直肠膨大；透明尾区界限明显，尾尖钝圆（图2-a，b）。具体测量值为（n=20）：体长（L）为383～475 μm，体宽（W）为14.3～17.7 μm，口针长（ST）为11.8～13.5 μm，背食道腺开口到口针基球附近的距离（DGO）为3.2～5.8 μm，尾长（Tail）为46.2～61.5 μm。雌虫会阴花纹呈椭圆形，背弓较高，线纹紧密且细，呈波浪形（图2-c），且大多数会阴花纹无侧线，少数具1条或2条不明显的侧线。

图2 香瓜根结线虫形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of the muskmelon rootknot nematode

2.2 分子鉴定利用根结线虫通用引物V5367和26s，对该种群的rDNA-ITS区序列进行扩增，均获得了大小约750 bp的电泳条带（图3-a），B1astN同源性搜索比对显示，该种群与NCBI数据库中的象耳豆根结线虫（M. enterolobii）一致性为99.9%。利用象耳豆根结线虫特异性引物MeF/MeR扩增该种群的ITS2序列，均获得长度约300 bp的特异条带，空白对照无扩增条带（图3-b）。

图3 香瓜根结线虫rDNA-ITS (a) 及ITS2 (b) 序列扩增Fig. 3 Amplification of rDNA-ITS (a) and ITS2 (b) sequence of the muskmelon root-knot nematode

2.3 3种杀线剂对象耳豆根结线虫2龄幼虫的毒力由表2可知，供试药剂处理24 h后，3种杀线剂对象耳豆根结线虫2龄幼虫的毒力大小顺序为阿维菌素>噻唑膦>氟吡菌酰胺，LC50值分别为0.351、0.820和7.783 mg·L−1。

表2 3种杀线虫剂对象耳豆根结线虫的室内毒力Tab. 2 The toxicity of 3 nematicides to M. enterolobii in laboratory

3 讨 论

经形态学和分子生物学鉴定，本实验采集的香瓜根结线虫种类确定为象耳豆根结线虫（M.enterolobii），这是国内首次发现象耳豆根结线虫侵染危害香瓜。国内外已报道象耳豆根结线虫可以侵染包括豆科、茄科、葫芦科中的多种蔬菜，以及玉米、棉花、烟草等重要粮食和经济作物[12−15]。研究发现，象耳豆根结线虫比南方根结线虫、爪哇根结线虫等常见种类具有更强的致病力，能够克服N、Mi-1、Mh、Rk等多个抗病基因，被认为是最具危害性的植物病原根结线虫之一[16]。值得高度警惕的是，近年来象耳豆根结线虫在海南全省快速扩散蔓延，已取代南方根结线虫成为冬季瓜菜上的优势种类，对瓜菜产业生产安全构成了严重现实威胁。

选用高效低毒化学杀线剂是现阶段防治根结线虫病害的主要手段。本研究选用几种主流的杀线剂原药进行室内毒力测定发现，阿维菌素对象耳豆根结线虫幼虫具有最高的杀虫活性（LC50=0.351 mg·L−1），噻唑膦（LC50=0.82 mg·L−1）和氟吡菌酰胺对象耳豆根结线虫幼虫的杀虫活性（LC50）分别为0.82 mg·L−1和7.783 mg·L−1。FASKE等[17]和YUE等[18]测定阿维菌素对南方根结线虫幼虫的LC50值分别为0.42 mg·L−1和0.68 mg·L−1，与本研究测定的对象耳豆根结线虫的毒力大小相近，表明阿维菌素是一种较稳定且高效的药剂。另外，YUE等[18]测定氟吡菌酰胺对南方根结线虫LC50值为0.13 mg·L−1，与本研究测定的对象耳豆根结线虫的毒力差异较大，原因很可能是由于采集的香瓜象耳豆根结线虫种群对氟吡菌酰胺已产生了一定的抗药性。本研究测定的不同类型杀线剂的室内毒力结果是指导田间用药的一个理论依据，但由于实际防治效果还受到剂型、助剂、线虫抗药性水平等多种因素的影响，下一步还需对含有阿维菌素、噻唑膦和氟吡菌酰胺等有效成分的商品制剂进行田间测试验证。