NaCl胁迫对不同来源木豆种子发芽及幼苗生长的影响

李拴林，罗小燕，陈志祥，吴如月，廖 丽，丁西朋

（1. 海南大学 热带作物学院，海口 570288; 2. 中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海口 571101;3. 南京农业大学 草业学院，南京 210095）

土地盐渍化是当今世界环境的严重问题之一[1]。目前，全世界有超过10亿hm2的土地因盐碱度过高而不能被有效利用，且日益加剧，严重制约了全球农业生产和生态环境的可持续发展[2−3]。随着经济的发展和耕地的减少，人们越来越重视对盐碱地的开发和利用。培育耐盐品种是利用和改良盐碱地的有效途径之一，耐盐作物种质资源的筛选、鉴定与评价是开展作物耐盐机理研究和作物耐盐新品种培育的基础[4]。在水稻[5]、大豆[6]、谷子[7]、辣椒[8]、海雀稗[9]和牧草[10]等作物中已开展了大量的种质资源耐盐评价工作，并培育出了盐丰47水稻、鲁苜1号苜蓿等多个耐盐作物新品种，且已进行了大面积的推广示范[11−12]。木豆（Cajanus cajan）起源于印度，非洲、澳大利亚、西印度群岛等热带、亚热带地区均有栽培，在全世界的种植面积约464万hm2[13]。在我国云南、广西、海南、江西和贵州等南方省（区）均有栽培，现有栽培面积约2万hm2[14]。木豆籽含有人体必需的8种氨基酸，是世界六大食用豆类之一；木豆叶片富含蛋白，是优质的蛋白饲料；木豆根系发达、固氮能力强，是理想的植被恢复和土壤改良树种；木豆还具很高的药用价值，如有清热解毒、治疗水痘、疟疾和股骨头坏死等疾病的功效[15]。木豆兼具生态效益、经济效益和社会效益，其开发利用前景很大[16]。在木豆主产区，盐胁迫是制约其种植的重要环境因素之一[17−18]，且不同木豆种质资源间的耐盐性存在较大差异，为此不同木豆种质资源间的耐盐性研究是木豆耐盐机理研究和耐盐新品种培育的重要基础[19−20]。本实验探究木豆发芽期与幼苗期的耐盐性差异，旨在建立木豆种质资源耐盐筛选评价体系，为开展木豆种质资源耐盐评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料通过前期田间植物学性状观察，选择植物学性状差异较大且来源不同的5份木豆种质资源作为供试材料（表1）。挑选当年收获的健康、均一、饱满的木豆种子开展耐盐胁迫实验。

1.2 方法萌发期实验采用培养皿发芽法，每皿放50粒种子，共设6个NaCl胁迫处理（0.15%、0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50%NaCl）和1个对照（CK，清水），每处理4次重复，种子均匀摆放在2层滤纸上，加入10 mL不同质量分数的NaCl，置于光照培养箱中。培养条件：25 ℃光照18 h，16 ℃黑暗6 h，湿度85%。每天定时更换NaCl溶液。从第2天起每日定时调查1次发芽率，萌芽时间为6 d。实验结束时记录胚根和胚芽的长度。计算发芽率（GR）和发芽指数（GI）。

式中GR为发芽率；n代表正常发芽粒数；N代表供试种子数。

式中GI为发芽指数；Gt为处理后t日的发芽数；Dt为相应的发芽日数。

苗期试验采用水培法[21]。先用沙培法进行育苗，具体为木豆种子事先用1%HgCl2进行消毒，随后将木豆种子用纯净水清洗5～6次，再将木豆种子用70 ℃水浸种5 min，静置8 h后将木豆种子播种于用无菌水洗涤干净且装好沙子的育苗盘中，在室温条件下培养。待子叶展开后，选择生长状况一致的木豆幼苗，移入1/5强度的霍格兰营养液中培养2 d，再进行NaCl胁迫处理。试验设5个NaCl质量分数处理（0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%NaCl）和1个对照（CK，清水），4次重复，每重复10株。实验期间，每天下午16：00补充清水至实验初始体积，确保培养液中NaCl质量分数相对稳定。NaCl胁迫培养15 d后，采用直接测量法测定株高、单株根鲜质量，单株根干质量和存活株数，计算株高相对生长量（H）和存活率。用模糊数学中的隶属函数值法对木豆资源的耐盐性进行综合评价。

式中，H为株高相对生长量；Ht为处理后的株高；H0为处理前的株高。

式中，Xu为隶属函数；隶属函数X表示所有参试材料某一指标的测量值，Xmin和Xmax分别为所有参试材料某一指标的最小值和最大值。

1.3 数据分析利用IBM SPSS 22.0软件和Microsoft Excel 2019软件对实验数据进行统计分析，确定不同来源木豆种质资源的耐盐能力。以不同NaCl处理的木豆种子发芽率和幼苗存活率为自变量，NaCl处理的质量分数为因变量建立一元二次回归方程，参考文献[22]的方法，以木豆种子50%发芽率和幼苗50%存活率为标准分别计算萌发期和幼苗期木豆NaCl胁迫临界值。

2 结果与分析

2.1 不同质量分数NaCl溶液对木豆种子发芽的影响

2.1.1 不同质量分数NaCl溶液对木豆种子发芽率的影响发芽率实验结果见表2，由表2可见，5份木豆种子的发芽率随着NaCl质量分数的增加均呈显著下降趋势，但不同来源的木豆种子间的发芽率下降幅度不同。在NaCl质量分数为0.15%时，除MD1的发芽率和对照没有显著差异外，GD1、YN1、YD1和GX1的发芽率均显著低于对照。当NaCl质量分数为0.60%时，GD1、MD1和GX1的发芽率高于50%，YD1的发芽率低于50%，而YN1的发芽率低于30%。NaCl质量分数为0.90%时，5份木豆种子的发芽率均低于50%，YD1的发芽率降至25.23%，YN1的发芽率低至10.77%。NaCl质量分数为1.50%时，仅GX1和MD1的发芽率大于10%，GD1和YD1的发芽率仅为8.73%和8.03%，而YN1则完全不发芽。

表2 不同质量分数NaCl溶液对木豆种子发芽率的影响Tab. 2 The effect of NaCl solution with different concentrations on the germination rate of pigeonpea seeds

2.1.2 不同质量分数的NaCl溶液对木豆种子发芽指数的影响发芽指数分析结果见表3，由表3可见，随着NaCl质量分数的提高，5份木豆种子的发芽指数总体呈下降趋势，不同来源的木豆种子间发芽指数的下降幅度不同。NaCl质量分数为0.15%时，GD1、MD1、GX1的发芽指数与对照相比有所下降，但差异不显著，YN1和YD1的发芽指数则显著低于对照。NaCl质量分数为0.30%时，5份木豆种子的发芽指数均显著低于对照，MD1的发芽指数为27.60，明显高于其他4份木豆，YN1的发芽指数低于10。NaCl质量分数为0.60%时，MD1的发芽指数为22.90，YD1的发芽指数分别为10.25，GD1、GX1和YN1的发芽指数均低于10。NaCl质量分数为0.90%～1.20%时，仅MD1的发芽指数为15.83～12.53，其余4份木豆种子的发芽指数均低于10，YN1的发芽指数最低，降至2.13～0.74。当NaCl质量分数为1.50%时，MD1发芽指数为7.83，YD1、GD1和GX1的发芽指数均降至5.0以下，而YN1因不能发芽，所以发芽指数为零。

表3 不同质量分数NaCl溶液对木豆种子发芽指数的影响Tab. 3 The effect of NaCl solution with different concentrations on the germination index of pigeonpea seeds

2.1.3 不同质量分数的NaCl溶液对木豆胚根生长的影响在不同NaCl质量分数条件下对不同木豆种子的胚根长度进行测量，结果表明：木豆种子胚根生长受NaCl质量分数抑制明显，不同木豆胚根生长受抑制程度不同（表4）。当NaCl质量分数为0.15%时，GX1和GD1的胚根长度略大于对照，但差异不显著，而MD1、YN1和YD1的胚根长度均显著小于对照；NaCl质量分数为0.30%时，除GX1的胚根长度和对照相当外，其他4份木豆种子的胚根长度均显著小于对照；当NaCl质量分数达到0.60%时，5份木豆的胚根长度均显著小于对照，木豆种子胚根的生长受到明显抑制，其中YN1的胚根长度仅为2.20 mm；当NaCl质量分数高于0.90%时，木豆种子胚根受到严重抑制，生长缓慢。

表4 不同质量分数NaCl溶液对木豆胚根生长的影响Tab. 4 The effect of NaCl solution with different concentrations on the growth of pigeonpea radicle

2.1.4 不同质量分数NaCl溶液对木豆胚芽生长的影响在不同NaCl质量分数条件下对不同木豆种子的胚芽长度进行测量，结果表明：木豆种子胚芽生长受NaCl质量分数抑制作用明显，不同木豆胚芽生长受抑制程度不同（表5）。当NaCl质量分数为0.15%时，GD1和YD1的胚芽略长于对照，GX1的胚芽略短于对照，但差异均不显著，而MD1和YN1的胚芽则显著短于对照，其中YN1胚芽长度仅为对照的50%；当NaCl质量分数为0.30%时，5份木豆的胚芽长度都显著短于对照，木豆种子胚芽的生长受到明显抑制；NaCl质量分数为0.60%～1.20%时，5份木豆的胚芽生长进一步被抑制，胚芽长度在不同NaCl质量分数之间没有显著差异；当NaCl质量分数为1.50%时，木豆种子胚芽受到严重抑制，生长缓慢。

表5 不同质量分数NaCl溶液对木豆胚芽生长的影响Tab. 5 The effect of NaCl solution with different concentrations on the growth of pigeonpea plumule

2.2 不同质量分数的NaCl溶液对木豆幼苗生长的影响

2.2.1 不同质量分数的NaCl溶液对木豆幼苗根生长的影响通过水培试验，在不同NaCl质量分数条件下测定木豆幼苗根的鲜质量和干质量，结果表明，NaCl胁迫对木豆幼苗根生长显著抑制，根鲜质量和干质量均随着NaCl质量分数的增加不断减小（表6）。当NaCl质量分数为0.20%时，GX1和MD1木豆单株根鲜干质量均有所下降，但和对照相比差异不显著，GD1、YD1和YN1的单株根鲜、干质量均显著低于对照；当NaCl质量分数为0.40%时，5份木豆单株根鲜质量均显著低于对照，除MD1单株根干质量与对照差异不显著，其他4份单株根干质量均显著低于对照。当NaCl质量分数大于0.60%时，5份木豆单株根鲜、干质量均显著低于对照，根生长严重受抑制。

表6 NaCl胁迫对木豆幼苗根生长的影响Tab. 6 The effect of NaCl stress on the root growth of pigeonpea seedlings

2.2.2 不同质量分数的NaCl溶液对木豆幼苗株高相对生长量的影响木豆幼苗株高相对生长量分析结果（表7）表明，NaCl胁迫对木豆幼苗地上部生长显著抑制，株高相对生长量随着NaCl质量分数增加显著降低。当NaCl质量分数为0.20%～0.40%时，5份木豆幼苗地上部生长缓慢，其株高相对生长量均显著低于对照；当NaCl质量分数为0.60%时，MD1、GX1和GD1幼苗地上部缓慢生长，YD1和YN1幼苗地上部生长完全被抑制，株高相对生长量为零；当NaCl质量分数为0.80%时，MD1和GX1幼苗地上部仍缓慢生长，而GD1、YD1和YN1幼苗地上部生长完全被抑制，株高相对生长量为零；当NaCl质量分数为0.80%时，5份木豆幼苗株高相对生长量均为零，地上部生长完全被抑制。

表7 NaCl胁迫对木豆幼苗株高相对生长量的影响Tab. 7 The effects of NaCl stress on relative growth of plant height of pigeonpea seedlings

2.2.3 不同质量分数的NaCl溶液对木豆幼苗存活率的影响木豆幼苗存活率分析结果（表8）表明，随NaCl质量分数增加木豆幼苗存活率显著降低，不同木豆成活率下降幅度差异较大。当NaCl质量分数为0.20%时，5份木豆幼苗的存活率均显著下降，但MD1和GX1的存活率下降相对较小，YD1的存活率下降最大，降至50.33%左右；当NaCl质量分数为0.40%时，5份木豆幼苗的存活率均进一步下降，YD1和YN1幼苗的存活率分别降至25.20%和35.53%，其他幼苗的存活率在58%以上；当NaCl质量分数为0.60%时，MD1、GX1和GD1幼苗存活率均降至35%左右，YN1的存活率仅为5.07%左右，而YD1则全部死亡；当NaCl质量分数为0.80%时，MD1幼苗存活率降至15.73%，GX1和GD1的存活率分别仅为6.93%和5.73%，YD1和YN1幼苗则全部死亡；当NaCl质量分数为1.00%时，5份木豆幼苗均全部死亡。

表8 NaCl胁迫对木豆幼苗成活率的影响Tab. 8 The effect of NaCl stress on the survival rate of pigeonpea seedlings

2.3 木豆耐盐性综合评价对种子萌发期的发芽率、发芽指数、胚根长度和胚芽长度及幼苗期的单株根鲜质量、单株根干质量、株高相对生长量和成活率进行隶属函数分析 (表9，表10)。通过对隶属均值的比较可以得出在萌发期5份不同来源木豆种子的耐盐能力依次为MD1>GX1>YD1>GD1>YN1，幼苗期的耐盐能力依次为MD1>GX1>GD1>YD1>YN1，MD1和GX1为耐盐种质，YD1和YN1为盐敏感种质。

表9 木豆种子萌发期耐盐性综合评价Tab. 9 Comprehensive evaluation of salt tolerance of pigeonpea seeds at the germination stage

表10 木豆幼苗期耐盐性综合评价Tab. 10 Comprehensive evaluation of salt tolerance of pigeonpea at the seedling stage

2.4 木豆NaCl溶液胁迫临界值通过建立一元二次回归方程计算木豆萌发期及幼苗期NaCl胁迫临界值（表11）。萌发期以50%发芽率为标准，确定5份木豆种子NaCl胁迫临界质量分数值范围为0.377%～0.748 %，平均为0.605%。不同木豆种子的NaCl胁迫临界值不同，其中GX1和MD1种子的临界值较大，分别为0.748%和0.744%，YN1种子的临界值最小。幼苗期以50%存活率为标准，确定5份木豆幼苗NaCl胁迫临界值为0.275%～0.510 %，平均为0.420%。不同木豆幼苗的NaCl胁迫临界值差异较大，其中MD1和GX1幼苗的临界值较大，分别为0.510%和0.481%，YD1和YN1幼苗的临界值较小，分别为0.275%和0.371%。

表11 木豆NaCl胁迫临界质量分数的确定Tab. 11 Determination of critical concentration of NaCl stress for pigeonpea accessions

3 讨 论

植物的耐盐性是随发育时期而变化的，其中种子萌发期和幼苗期是对盐分最敏感时期，因此，在种质资源耐盐性筛选评价时一般选择在这2个时期进行[23]。本研究结果显示，5份不同来源木豆种质资源在萌发期不同质量分数NaCl处理下的发芽率、发芽指数、胚根长度和胚芽长度均随NaCl质量分数的增大而减小，这与相关研究结果[20]基本一致。当NaCl质量分数为0.60%时，木豆种子萌发相关的各项指标均急剧下降，且在不同木豆种质间表现出显著差异。以50%发芽率为标准，通过回归方程计算出5份木豆种子萌发期的NaCl胁迫临界质量分数值为0.605%，而在幼苗期，5份不同来源木豆种质资源在不同NaCl质量分数处理下的单株根鲜/干质量、株高相对生长量和存活率均随NaCl质量分数的增大而减小。当NaCl质量分数为0.40%～0.60%时，木豆幼苗的各项指标均急剧下降，且在不同木豆种质间表现出显著差异。以50%存活率为标准，通过回归方程计算出木豆幼苗NaCl胁迫临界质量分数值0.420%。因此，0.605% 、0.420%NaCl分别为种子萌发期和幼苗期开展木豆耐盐性评价的适宜质量分数。

植物的耐盐性状为多基因控制的数量性状，不同耐盐基因的表达时期存在差异，所以不同发育时期植物的耐盐性也存在差异[24]。本研究通过观测不同NaCl胁迫处理对5份不同来源木豆种子发芽及幼苗生长的影响，采用隶属函数法对木豆种质资源进行耐盐性综合评价发现，在不同时期5份木豆种质资源的耐盐能力强弱顺序并不完全一致，这可能是由于木豆不同生长发育阶段的耐盐性受不同的耐盐基因调控。这与小麦[25]、番茄[26]、黄瓜[27]、豇豆[28]等多种作物种质资源在种子萌发期和幼苗期耐盐性存在差别的结果类似。如董志刚等[26]发现在芽苗期和幼苗期耐盐和中等耐盐番茄材料相同率为53.85%；方先文等[29]发现芽期耐盐水稻品种在苗期耐盐性较差，而筛选出的苗期极端耐盐水稻品种在芽期受到高质量分数盐溶液的极显著抑制。所以, 在进行作物种质资源耐盐性评价筛选时, 要以多个生长发育阶段鉴定结果作为耐盐依据才能真实反映其耐盐能力。

本研究的5份木豆种质资源在不同质量分数NaCl溶液处理下的种子萌发特性和幼苗生长状况，采用隶属函数法鉴定出耐盐木豆种质MD1和GX1，盐敏感种质YN1。确定不同来源木豆种子萌发期和幼苗期NaCl胁迫临界值分别为0.377%～0.748%和0.275%～0.510%。