超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉、鸡蛋中9种兽药残留

李成 王锡兰 姚东校 徐彬

(1海南省食品药品检验所三亚分所海南三亚572000;2海南省食品检验检测中心海南海口570301)

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考属于氯霉素类药物，是一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用［1］，由于氯霉素对人体危害较大［2-3］，我国农业农村部第250号公告［4］已将氯霉素列在动物中禁止使用的药品及其他化合物清单中。甲砜霉素和氟苯尼考在GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》［5］中也规定了最大残留限量值。金刚烷胺和金刚乙胺同属抗病毒类药物，主要用于流感的预防和早期的治疗，但是大量的残留会对机体的神经系统造成较大的危害［6］，我国农业农村部已于2005年发布第560号公告禁止金刚烷胺和金刚乙胺兽用［7］。恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物具有广谱高效、价格低廉等优点，被广泛用于动物疾病治疗、预防及促生长方面，但长期不规范使用会产生药物残留和细菌耐药性问题［8］。农业农村部第2292号公告规定，在食品动物中停止使用培氟沙星和氧氟沙星，GB 31650—2019也对恩诺沙星在动物性食品中残留限量进行了明确规定。鸡蛋和鸡肉作为动物源食品的重要组成部分，含有丰富的优质蛋白，深受大众喜爱，鸡肉和鸡蛋食用安全的重要性不言而喻。但是目前国家标准和行业标准对动物源食品中兽药残留的检测多适用于鸡肉基质，而且同时检测鸡肉和鸡蛋中氯霉素类、抗病毒类和喹诺酮类兽药残留的研究较少，因此建立一种快速、灵敏、准确的方法同时检测鸡肉和鸡蛋中多兽药残留对鸡肉和鸡蛋类食品的食用安全性以及对其日常的监管具有重要意义。

兽药残留的检测方法主要有气相色谱法［9］、气相色谱-串联质谱法［10-11］、液相色谱法［12］、超高效液相色谱-串联质谱法［13-16］等，其中超高效液相色谱-串联质谱法是目前最为常用的方法。现有方法普遍存在问题是大多前处理需要对样品进行液-液萃取、固相萃取柱净化，部分方法需要进行衍生化，过程繁琐操作复杂、耗时长而且会消耗大量有机试剂，不适合大通量样品筛查。本研究采用Waters PRIME HLB固相萃取柱净化，无需活化平衡，前处理过程简单，试剂消耗量小，省时省力，经济节约。既保证了检验的准确度，又提高了工作效率。

本研究选取了日常检测中风险较高的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等9种药物，建立一种适合鸡肉和鸡蛋中多兽药残留同时分析的检测方法，以期为食品安全监测提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备

LC-30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；QTRAP 5500三重四极杆液相色谱质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；Multi Reax全能型振荡器（德国Heidolph公司）；KQ5200E超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；3-30KS离心机（德国Sigma公司）；MTN-2800W氮吹仪（天津奥特赛恩仪器有限公司）；XS 204电子分析天平（瑞士Mettler-To‐ledo公司）；Milli-Q超纯水制备系统（德国默克公司）。

1.1.2 标准品

氯霉素（1 000 μg/mL）、氯霉素-D5（100 μg/mL）、甲砜霉素（100 μg/mL）、氟苯尼考（1 000 μg/mL）、金刚烷胺（100 μg/mL）、金刚乙胺（100 μg/mL）、恩诺沙星（100 μg/mL）、环丙沙星（1 000 μg/mL）、氧氟沙星（1 000 μg/mL）、诺氟沙星（100 μg/mL）（阿 尔 塔公司）。

1.1.3 试剂耗材

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙酸铵（色谱纯，美国ThermoFisher Scientific公司）；甲酸（色谱纯，上海aladdin公司）；Waters Oasis PRIME HLB固 相 萃 取 柱（200 mg/6 mL，美 国Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

混合标准中间液（10 μg/mL）：分别准确吸取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星标准品适量于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，置于-20℃冰箱中保存。

混合标准工作液（1 μg/mL）：准确吸取混合标准中间液0.5 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，置于-20℃冰箱中保存。

同位素内标中间液（1 μg/mL）：准确吸取氯霉素-D5标准溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，置于-20℃冰箱中保存。

同位素内标工作液（100 ng/mL）：准确吸取同位素内标中间液1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 样品处理

称取经均质样品2 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入100 μL同位素内标工作液和10 mL含0.2%甲酸的80%乙腈水（V∶V）溶液，漩涡混匀2 min，置于超声波清洗器中超声提取10 min，9 000 r/min离心5 min。无需活化平衡，将全部提取液加载到PRIME HLB固相萃取柱，样液在重力作用下过柱，收集全部流出液。在40°C下氮气吹至近干，用含0.1%甲酸的乙腈水（10∶90，V∶V）溶解定容至1 mL，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，上LC-MS/MS测定。

1.2.3 仪器分析条件

1.2.3.1 液相色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），美国Waters公司；柱温：40°C；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL。流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：乙腈。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相洗脱梯度

1.2.3.2 质谱条件

电喷雾电离源（ESI）；电喷雾电压（ESI-）：-4 500 V；电喷雾电压（ESI+）：5 500 V；离子源温度：550°C；雾化气（GS1）：55 psi；加热气（GS2）：55 psi；气帘气（CUR）：30 psi；多反应监测模式（MRM）。其它质谱参数见表2。

表2 质谱分析参数

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

本研究选取Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Agilent XDB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）等3种不同型号色谱柱进行分离研究。结果表明，在同等色谱条件下，9种化合物在Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱上的色谱峰形最好，分离度最佳。因此选择Waters Acquity UPLC BEH C18柱进行测定。

2.1.2 流动相的选择

为了提高化合物的离子化效率，提高响应值以及改善化合物峰形，本研究比较了水/甲醇、水/乙腈、0.1%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）/乙腈等流动相体系对目标化合物的影响。研究发现，当流动相为水/甲醇或水/乙腈时部分目标物峰展宽，响应值相对较低；流动相加入甲酸后，增加了目标化合物的电离效率，响应值普遍增大；流动相加入乙酸铵后部分化合物峰形得到改善，但有部分化合物响应值降低，综合考虑选取0.1%甲酸水/乙腈为流动相。通过优化流动相梯度洗脱程序，9种目标化合物达到较好分离，色谱峰峰型良好。各目标化合物定量离子对提取质谱图见图1。

图1 九种兽药定量离子对提取质谱图

2.2 样品处理的优化

2.2.1 提取溶液的选择

鸡肉和鸡蛋中含有大量的蛋白质、脂肪及磷脂类［16-17］，干扰目标化合物的分析，因此需要选择合适的提取试剂以达到既能排除干扰，又能充分提取目标化合物的目的。本研究首先比较了甲醇、乙腈和乙酸乙酯对鸡肉基质的提取效果。研究表明，用甲醇提取回收率较低，乙酸乙酯提取基质干扰较大，用乙腈提取沉淀蛋白的效果好，回收率高且重复性较好。用同样的方法对鸡蛋进行试验，发现乙腈的提取效果最好，因此选择乙腈作为提取液进行进一步研究。试验分别比较了70%、80%、90%乙腈水溶液及纯乙腈溶液的提取效率和净化效果，同时根据李明［18］、刘新辉［19］等研究比较了加入0.2%甲酸对提取效率的影响。结果发现70%乙腈水溶液提取时提取液浑浊，过PRIME HLB固相萃取柱困难且回收率低，90%乙腈水溶液和纯乙腈提取时部分化合物基质干扰影响较大，80%乙腈水溶液提取基质干扰较小，回收率较高。加入甲酸后提取效率普遍增高，含0.2%甲酸的80%乙腈水（V∶V）溶液能同时兼顾9种不同化合物的提取效率。以鸡肉中金刚烷胺为例，见图2。

图2 不同提取溶剂对鸡肉中金刚烷胺的影响

续图1九种兽药定量离子对提取质谱图

2.2.2 固相萃取柱的选择

本研究比较了HLB柱、MCX柱和PRIME HLB柱的净化效果。按照1.2.2进行加标回收试验，采用上述3种净化柱净化。对比发现经HLB柱和MCX柱净化后样品的回收偏低，平行样品间相对偏差较大。经PRIME HLB柱净化后样品基质干扰较小，9种化合物回收率高且稳定，而且PRIME HLB柱是一种杂质吸附型固相萃取柱，能有效去除鸡蛋和鸡肉中脂肪和磷脂［20］，无需活化平衡，操作简便，减少有机试剂的使用，综合考虑选择PRIME HLB柱作为净化柱。

2.3 标准曲线和检出限

用按照1.2.2处理得到的阴性样品处理液，将混合标准工作液配制成质量浓度分别为0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的混合标准曲线工作液，同位素内标浓度为10 ng/mL进行上机测定。以目标化合物浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。9种目标化合物均呈现较好的线性关系，相关系数r均大于0.997，见表3。按照信噪比的3倍（S/N＝3）和10倍（S/N＝10）分别对应目标化合物浓度作为检出限和定量限的规则，9种目标化合物的检出限为0.05 μg/kg，定 量 限 为0.5 μg/kg，低 于GB/T 20756—2006［21］、GB/T 20366—2006［22］等 国家 标准检出限和定量限的要求。

表3 九种目标化合物的线性关系、检出限、定量限

2.4 回收率和精密度

分别在阴性样品中添加低、中、高3个浓度水平的9种混合标准使用液，每个水平做6个平行样，根据1.2.2方法进行前处理，平均回收率为74.6%～119.1%，RSD范围为0.9%～7.6%，见表4，说明本方法回收率及精密度较好。

表4 九种目标化合物的回收率及相对标准偏差（n=6）

2.5 实际样品检测

采用上述方法检测本市农贸市场随机抽取的5份鸡肉样品和20份鸡蛋样品。其中一份鸡蛋样品检测出恩诺沙星，检测值为7.7 μg/kg，其余样品均未检测出上述9种药物。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定鸡肉和鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金刚烷胺、金刚乙胺、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星等兽药残留量的方法。优化了色谱条件、质谱条件、样品前处理方法和样品净化方式。本方法检出限低，回收率高、精密度好，为同时检测鸡肉和鸡蛋中多兽药残留提供了一种便捷可靠的方法，能够满足检验检测机构日常样品筛查和研究的需要。