刚地弓形虫SRS29C截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建

袁娣，邵怡，张同瑶，姜阜杉，李秀荣，宋淇淇，通信作者

刚地弓形虫截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建

袁娣1，邵怡1，张同瑶1，姜阜杉1，李秀荣2，宋淇淇1，通信作者

（1.天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2.巴彦淖尔市临河区农畜产品质量安全中心，内蒙古自治区 巴彦淖尔 015000）

为构建刚地弓形虫基因原核表达质粒，利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列，去除前端信号肽序列，设计引物并扩增截短型基因序列，克隆并构建原核表达质粒。结果显示：基因前51位氨基酸为信号肽区域，故将此段信号肽序列切除，获得长度为 966 bp的截短型基因片段（SRS29Ccut），成功构建原核表达质粒pET-28a-SRS29Ccut和pET-32a-SRS29Ccut。此研究为今后对刚地弓形虫SRS29C蛋白的生物学功能及免疫特性进行更深入研究打下基础。

刚地弓形虫；；截短型基因；原核表达质粒

刚地弓形虫是一种重要的人畜共患寄生虫，可以感染包括人在内的几乎所有温血动物[1]。弓形虫病具有极高的感染率，其感染主要是由不良或不干净的饮食习惯和不合理饲养宠物等引起，人通过误食未煮熟的含有弓形虫包囊或速殖子的畜禽肉食或接触感染猫粪便中的卵囊而感染[2]。免疫功能正常的人类感染弓形虫后一般没有明显症状，而免疫功能亢进患者感染后可能患脑炎，免疫功能受损的感染患者和经胎盘获得弓形虫的先天性弓形虫病患者可能发生严重疾病，且如果在怀孕期间感染会导致孕妇流产、死产或畸胎[3]。

弓形虫SRS蛋白家族是弓形虫的虫体表面抗原，部分SRS家族成员经研究证实在弓形虫的粘附、入侵、与宿主免疫系统进行互作等方面发挥重要作用。目前已知的多种刚地弓形虫虫体表面抗原均属于SRS（SAG1-related sequence）蛋白超家族，其具有N端信号肽和C端疏水区域，成熟蛋白通过一个糖基磷脂酰化（GPI）锚定位点与弓形虫外表膜连接[4]。SRS抗原一方面在入侵宿主细胞、免疫调节和毒力衰减等方面发挥作用；另一方面，也为弓形虫在宿主环境中生存提供相应保护。

SRS家族主要有两个分支，SAG1样序列家族和SAG2样序列家族。通过序列分析，该家族有161个SAG1相关序列（SRS）编码，能组成多种结构相关但抗原性不同的虫体表面蛋白。SRS蛋白质的表达具有期特异性[5-6]，其中，SAG1家族的蛋白主要表达在弓形虫速殖子时期，包括SAG1、SAG2A、SAG3、SRS2、SRS3等；SAG2家族则选择性地表达在缓殖子期，包括SAG2C、SAG2D、SAG2X、SAG2Y、BSR4、BAG1、SRS9等[7-9]，而SRS44和SRS13则在包囊囊壁上表达[10-11]。由此可以看出，弓形虫生命周期中，速殖子、缓殖子和包囊的表面抗原表达谱具有明显的独特性，表面抗原相关序列不一样，呈现出了不同的生物学特性和作用[12]。在弓形虫终末宿主猫科动物的肠道内，SRSs蛋白可以促进识别大、小配子，受精和产生、扩散卵囊，以及免疫反应的能力，对肠道炎症和腹泻起到重要的作用[13]。所以，SRSs蛋白常被作为候选疫苗的成分之一。

本项目以弓形虫基因作为研究对象，利用SignalP-5.0软件对基因的N端信号肽进行预测，去除其信号肽序列，设计扩增截短型基因的PCR引物，此后通过PCR方法获得的截短基因序列，将其连接到原核表达载体pET-28a和pET-32a中构建原核表达质粒。本研究可以为今后对刚地弓形虫SRS29C蛋白的生物学功能及免疫特性进行更深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及主要试剂

质粒pET-28a(＋)以及pET-32a(＋) 购自Novagen生物工程公司；pEASY-Blunt克隆试剂盒以及Trans-T1感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。

限制性内切酶Ⅰ和Ⅰ、T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司（Takara）；Fast Pfu DNA聚合酶、DNA Marker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；质粒 DNA小量提取试剂盒购自天根生物技术有限公司。

刚地弓形虫阳性DNA模板为本实验室保存。PCR引物的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1信号肽预测

于NCBI所公布的刚地弓形虫ME49株全基因组信息中下载基因序列（＞NC_031476.1：2670839-2673590），其中CDS序列为1 119 bp。将此段CDS序列翻译为对应的氨基酸序列后利用信号肽预测软件SignalP-5.0对的N端信号肽进行分析。

1.2.2 PCR引物设计及PCR扩增

根据信号肽预测的结果，去除所预测的N端信号肽序列，设计扩增截短序列的PCR引物，在上游和下游引物分别加入Ⅰ和Ⅰ的酶切位点（已用下划线标出），具体引物序列如下：

SRS29CF：5'-ATGGGGCCGCCGTACAGATACGAGCC-3'

SRS29CR：5'-ACCAATAGGCAAGTGCCGTCATCGC-3'

此后，按表1所示的PCR扩增反应体系进行PCR扩增体系配制，同时设阴性对照。

表1 PCR扩增反应体系 μL

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30s；35个循环，最后一个循环结束后72 ℃过延伸5min，最后置于15 ℃保温。

PCR反应结束后将PCR产物取出，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3截短型基因片段回收

参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书对PCR扩增产物进行回收。

1.2.4 克隆质粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut构建

将回收的DNA片段直接与平末端克隆载体pEASY-Blunt连接，反应体系见表2。

表2 连接反应体系 μL

将反应物混合均匀后置于PCR仪控温25 ℃，反应10 min，反应结束后，取出离心管置于冰上，利用Trans-T1感受态细胞进行转化。此后，于转化后过夜培养的平板上挑取单菌落，接种于LB/Amp＋或LB/Kan＋的液体培养基中，180 r/min、37 ℃振荡培养6～8 h，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，此后用Ⅰ和Ⅰ进行双酶切，双酶切反应体系如表3，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，将正确的克隆质粒送至测序公司进行基因序列测定。

表3 双酶切反应体系 μL

1.2.5 原核表达质粒的构建

将原核表达载体质粒pET-28a（＋）和pET-32a (＋)以及测序正确的克隆质粒pEASY-Blunt- SRS29Ccut分别用Ⅰ和Ⅰ限制性内切酶进行双酶切，双酶切体系见表3，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收pET-28a和pET-32a载体片段以及带有Ⅰ和Ⅰ酶切位点的截短型基因片段，然后利用T4连接酶分别将pET-28a/SRS29Ccut以及pET-32a/SRS29Ccut于16℃连接过夜。连接体系如表4、表5所示。

表4 pET-28a/SRS29Ccut连接反应体系 μL

表5 pET-32a/SRS29Ccut连接反应体系 μL

连接反应完成后分别将连接产物利用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化。此后，于转化后过夜培养的平板上挑取单菌落，接种于LB/Kan＋（pET-28a/SRS29Ccut）或LB/Amp＋（pET-32a/ SRS29Ccut）的液体培养基中，180 r/min、37℃振荡培养6～8 h，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，此后用Ⅰ和Ⅰ进行双酶切，双酶切反应体系如表3，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，确定构建成功的重组原核表达质粒pET-28a-SRS29Ccut和pET-32a-SRS29Ccut。

2 试验结果

2.1 SRS29C信号肽预测结果

基因的CDS序列为1 119 bp，将此段CDS序列翻译为对应的氨基酸序列（共372个）后利用信号肽预测软件SignalP-5.0对的N端信号肽进行预测，预测结果见图1。

在图1中，CS代表剪切位点的值，CS位点最高处代表信号肽剪切后的第一位氨基酸；SP代表信号肽区域，信号肽区域的SP值较高；OTHER代表综合考虑CS值以及SP值的参数。根据图1可知，氨基酸第52位为信号肽剪切后的第一位氨基酸，在第52位氨基酸之前，SP值较高。因此得出结论，的前51位氨基酸为信号肽区域，在后续构建原核表达质粒的过程中应该去除此段区域。因此后续截短型基因序列大小应为1 119－51×3＝966 bp。

2.2 SRS29C截短型基因的PCR扩增结果

以实验室保存的刚地弓形虫DNA作为模板，利用设计的PCR扩增引物SRS29CF以及SRS29CR进行截短型基因的PCR扩增，扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示。结果表明：与阴性对照相比，试验组在预测的目的基因大小（966 bp）附近出现了一条明显的条带。

注：M为DNA分子量标准；1为截短型基因PCR产物；2为阴性对照

2.3 克隆质粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut的构建

利用琼脂糖凝胶电泳对构建的克隆质粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，可以看到经过双酶切，克隆质粒被切割成约966 bp的SRS29Ccut目的基因片段以及约3 929 bp的pEASY-Blunt克隆载体片段，说明已经成功构建克隆质粒pEASY-Blunt-SRS29Ccut。

注：M为DNA分子量标准；1-4为克隆质粒pEASY- Blunt-SRS29Ccut的双酶切鉴定结果

2.4 原核表达质粒的构建

将回收后的SRS29Ccut基因片段和pET-28a、pET-32a分别连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒后用Ⅰ和Ⅰ进行双酶切鉴定。重组质粒pET-28a-SRS29Ccut的双酶切结果如图4所示，可以看到重组质粒经过双酶切反应之后，在966 bp目的基因大小处以及pET-28a空载体5 300 bp左右的位置出现明显的条带，说明原核表达质粒pET-28a-SRS29Ccut构建成功。

注：M为DNA分子量标准；1-6为pET-28a-SRS29Ccut的双酶切鉴定结果

重组质粒pET-32a-SRS29Ccut的双酶切结果如图5所示，可以看到重组质粒经过双酶切反应之后，在966 bp目的基因大小处以及pET-32a空载体5 900 bp左右的位置出现明显的条带，说明原核表达质粒pET-32a-SRS29Ccut构建成功。

注：M为DNA分子量标准；1-6为pET-32a-SRS29Ccut的双酶切鉴定结果

3 讨论

刚地弓形虫于1908年在北非突尼斯从梳趾鼠的肝、脾中首次发现，而在我国，于恩庶于1955年首次在猫和兔体内分离出弓形虫，谢天华于1962年报道了我国首例弓形虫病[14]。一直以来弓形虫隐性感染没有引起人们的重视，其实隐性感染给人类带来的危害也是十分严重的。弓形虫的包囊在脑组织中长期存在可能会引起某些精神疾病。据国外资料，精神病患者弓形虫的感染率在40.0%～50.0%左右，而在我国，精神病患者的弓形虫感染率在8.0%～22.4%[15]。

目前已知的弓形虫表面抗原被称为表面抗原糖蛋白相关序列（Surface antigen glycoprotein 1-related sequences，SRSs），其均具有N端信号肽以及C端疏水区域，且多以糖基磷脂酰化（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）形式锚定在细胞膜上[10]。SRSs蛋白家族在弓形虫生活史中发挥着重要的作用，主要表现在弓形虫的识别、入侵、粘附、致病等过程。刚地弓形虫（原名SRS2）与新孢子虫的SRS2具有高度同源性[16]，据报道新孢子虫的NcSRS2在新孢子虫粘附及入侵宿主细胞过程中发挥重要作用，且具有良好的免疫原性[17-19]，我们推测与新孢子虫的NcSRS2具有高度同源性的弓形虫SRS29C蛋白可能会在弓形虫中发挥相似的作用，极具研究价值。

本试验选择刚地弓形虫作为研究对象，以期望为SRSs蛋白家族后续更深入的研究提供理论基础或数据支持。由于在前期的试验当中，将全长序列扩增并尝试进行原核表达，在先后更换Transetta、BL21（plys）等感受态细胞后，原核表达始终无法得到理想结果。经推测可能是由于序列中N端具有信号肽而影响了其原核表达，因此在本次试验中，经过SignalP-5.0软件分析后去除了N端51个氨基酸的信号肽区域，重新设计了引物，获得了截短型基因并成功构建了原核表达质粒，为后续深入研究刚地弓形虫的生物学功能及免疫特性打下基础。

[1] 田维鹏，张念章，高琦，等.弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究[J].中国畜牧兽医杂志，2014，41（4）：27-31.

[2] 沈继龙，余莉.我国弓形虫病流行概况及防治基础研究进展[J].中国血吸虫病防治杂志，2019，31（1）：71-76.

[3] MONTOYA J G，LIESENFELD O.Toxoplasmosis[J].Lancet，2004，363（9425）：1965-1976.

[4] WASMUTH J D，PSZENNY V，HAILE S，et al.Integrated bioinformatic and targeted deletion analyses of the SRS gene superfamily identify SRS29C as a negative regulator of Toxoplasma virulence[J].Mbio，2012，3（6）：1-13.

[5] BOUCHER I W，MCMILLAN P J，GABRIELSEN M，et al.Structural and biochemical characterization of a mitochondrial peroxiredoxin from[J].Molecular Microbiology，2006，61（4）：948-959.

[6] GRIMWOOD J，SMITH J E.：The role of a 30-kDa surface protein in host cell invasion[J].Experimental Parasitology，1992，74（1）：106-111.

[7] KIM S K，KARASOV A，BOOTHROYD J C，et al.Bradyzoite-specific surface antigen SRS9 plays a role in maintainingpersistence in the brain and in host control of parasite replication in the intestine[J].Infection and Immunity，2007，75（4）：1626-1634.

[8] VAN T T，KIM S K，CAMPS M，et al.The BSR4 protein is up-regulated inbradyzoites, however the dominant surface antigen recognised by the P36 monoclonal antibody is SRS9[J].International Journal for Parasitology，2007，37（8-9）：877-885.

[9] MACÊDO A G，CUNHA J P，CARDOSO T H，et al.SAG2A protein frominteracts with both innate and adaptive immune compartments of infected hosts[J].Parasites and Vectors，2013，6（1）：163.

[10] TOMITA T，MA Y，WEISS L，et al.Characterization of a SRS13：a new cyst wall mucin-like domain containing protein[J].Parasitology Research，2018，117：2457-2466.

[11] TOMITA T，BZIK D J，MA Y F，et al.Thecyst wall protein CST1 is critical for cyst wallintegrity and promotes bradyzoite persistence[J].PLOS Pathogens，2013，9（12）：e1003823.

[12] 刘辉.弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因生物学特性的初步研究[D].上海：中国农业科学院，2019.

[13] GRIMWOOD J，SMITH J E.：The role of a 30-kDa surface protein in host cell invasion[J].Experimental Parasitology，1992，74（1）：106-111.

[14] 韩梅，吴寒.我国弓形虫病研究进展[J].医学信息，2018，31（2）：33-36.

[15] 李祥瑞.弓形虫病的流行的新趋势[J].动物医学进展，2010（A1）：234-236.

[16] HOWE D K，CRAWFORD A C，LINDSAY D，et al.The p29 and p35 immunodominant antigens oftachyzoites are homologous to the family of surface antigens of[J].Infect Immun，1998，66（11）：5322-5328.

[17] STASKA L M，DAVIES C J，BROWN W C，et al.Identification of vaccine candidate peptides in the NcSRS2 surface protein ofby using CD4＋ cytotoxic T lymphocytes and gamma interferon-secreting T lymphocytes of infected Holstein cattle[J].Infect Immun，2005，73（3）：1321-1329.

[18] NISHIKAWA Y，INOUE N，XUAN X，et al.Protective efficacy of vaccination by recombinant vaccinia virus againstinfection[J].Vaccine，2001，19（11- 12）：1381-1390.

[19] 刘梦丽，许正茂，吉尔格勒，等.新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答[J].中国动物传染病学报，2017，25（5）：47-52.

Cloning and construction of prokaryotic expression plasmid of truncatedgene of

Yuan Di1, Shao Yi1, Zhang Tongyao1, Jiang Fushan1, Li Xiurong2, Song Qiqi1,CorrespondingAuthor

（1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2.Agricultural and Animal Product Quality and Safety Center of Linhe district, Bayannaoer 015000, Inner Mongolia Autonomous Region, China）

In order to construct the prokaryotic expression plasmid ofgene, the signal peptide ofgene was predicted by using SignalP-5.0 software, the sequence of the signal peptide ofgene was removed, the truncated gene ofwas amplified and cloned, and then the prokaryotic expression plasmids were constructed.The results showed that the first 51 amino acids ofwere the signal peptide region, so by cutting off the signal peptide, the 966 bptruncated gene fragment (SRS29Ccut) was successfully obtained, and the recombinant plasmids pET-28a-SRS29Ccut and pET-32a-SRS29Ccut were successfully constructed.This study may lay a foundation for further study on the biological function and immune characteristics of the protein ofSRS29C.

;; truncated gene; prokaryotic expression plasmid

1008-5394（2021）03-0050-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.011

S855.9

A

2020-04-14

天津市自然科学基金项目（19JCQNJC13700）；天津市教委科研计划项目（2018KJ185）；天津市大学生创新训练计划项目（201803011）

袁娣（1997—），女，本科在读，动物医学专业。E-mail：yuandi1217@foxmail.com

宋淇淇（1986—），女，讲师，博士，主要从事兽医寄生虫学教学及研究工作。E-mail：qqs0606@163.com。

责任编辑：张爱婷