金黄色葡萄球菌定量检测质控考核结果与分析

罗可天，宋妙芳，吴桂芬，林 智

（广州市越秀区疾病预防控制中心，广东广州 510055）

金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中，在适当的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。无论在发达国家还是发展中国家，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占较大比例。在美国，金黄色葡萄球菌每年大约引起185 000例食物中毒；在我国，20%～25%的细菌性食物中毒病例是由金黄色葡萄球菌引起的[1]，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。我国国家卫生和计划生育委员会于2013年发布《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）[2]，在国家标准中制定了金黄色葡萄球菌的限量标准[3]，金黄色葡萄球菌定量检测是食源污染物监测的检验项目之一。为了提高实验室的金黄色葡萄球菌定量检测能力，笔者所在微生物实验室参加了2020广州市疾控中心组织的金黄色葡萄球菌定量检测质控考核活动，现对质控考核结果进行分析。

1 材料与方法

1.1 菌株及样品

1.1.1 菌株

实验对照菌株以金黄色葡萄球菌（ATCC25923）标准菌株为阳性对照，表皮葡萄球菌（ATCC12228）标准菌株为阴性对照。

1.1.2 样品

冻干粉末样品1瓶（由广州市疾病预防控制中心提供），代码为2020WS00008，检测项目为金黄色葡萄球菌定量。

1.2 试剂与仪器

Baird-Parker琼脂平板、革兰氏染色液、冻干兔血浆、血琼脂平板、TSA平板、脑心浸出液肉汤均由广东环凯生物科技有限责任公司提供，生理盐水、无菌水由微生物实验室制备，均在有效期内使用。

生物安全柜（AC2-6S1，新加坡艺思高科技有限公司）；生化培养箱（SPX-150B-Z，上海博迅实业有限公司）；显微镜（OLYMPUSCH-2，日本奥林巴斯株式会社）。

1.3 实验方法

样品到达后立即于2～8 ℃冰箱保存，试验前从冰箱中取出，使其达到室温后开启。然后按质控考核活动的作业指导书对样品进行处理。

1.3.1 样品前处理

生物安全柜内使用75%乙醇棉球对待检样品西林瓶外表面进行擦拭消毒，待75%乙醇挥干后，无菌打开西林瓶，立即加入无菌水2 mL对样品进行水化，待溶解后吸出放入无菌三角烧瓶。用2 mL无菌水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌三角烧瓶，重复4次。另吸取30 mL无菌水加入上述无菌三角烧瓶，充分混匀，制成样品均液。

以无菌吸管吸取25 mL样品均液，注于盛有225 mL生理盐水无菌三角烧瓶中，充分混匀，制成1∶10的样品均液。按以上操程序10倍系列稀释样品均液至1∶106。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管。

1.3.2 样品的接种

依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡球菌检验》（GB 4789.10—2010）中第二法[3]，吸取各稀释度样品均液1 mL，分别以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量加入3块Baird-Parker琼脂平板，然后用无菌涂布棒涂布。吸取各稀释度样品均液0.9 mL，分别以0.3 mL、0.3 mL、0.3 mL接种量加入3块Baird-Parker琼脂平板，然后用无菌涂布棒涂布。

1.3.3 培养

将两组不同接种量的Baird-Parker 琼脂平板室温放置10 min，待菌悬液被充分吸收后翻转平板，倒置后置于（36±1）℃，培养48 h。

1.3.4 菌落计数及鉴定

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡球菌检验》（GB 4789.10—2010）中第二法对Baird-Parker琼脂平板上的典型菌落进行计数和确认。

2 结果与分析

2.1 菌落形态

培养48 h后，样品在Baird-Parker琼脂平板上生长的菌落形态特征一致，均有圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈，符合金黄色葡萄球菌菌落形态的典型特征。

2.2 血浆凝固酶试验

分别挑取两组不同接种量在1∶10稀释度的BP琼脂平板上各5个菌落进行鉴定试验血浆凝固酶试验（同时采用表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌标准菌株做对照），10个疑似菌落血浆凝固酶试验均为阳性，同时划线接种到血平板（36±1）℃培养24 h，血平板上均为较大、圆形、光滑、凸起、湿润、金黄色的菌落，菌落周围可见完全透明溶血环。

2.3 染色镜检

均为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，根据检测结果及报告原则，两种不同接种量的鉴定结果均为检出金黄色葡萄球菌 1.6×103CFU/mL（表1）。

表1 金黄色葡萄球菌在BP平板上菌落计数记录情况

3 结论与讨论

在食品安全国家标准中，金黄色葡萄球菌定量检验是常规检验项目，是微生物致病菌定量检测质控考核的常见项目，参加实验室质量控制考核活动可作为一个外部监控指标，提示室内质控难以发现的偏差或系统误差，促进实验室的改进工作，提高检测质量，是判断和监控实验室能力的有效手段[4]。在实验的过程中，应注意以下问题：①在正式开始实验前对所用的试剂和培养基进行验证试验，确保试剂和培养基的质量符合试验要求；②样品从冰箱取出后，应放置至室温，进行水化必须静置足够的时间，以保证样品充分溶解；③熟练掌握稀释技术，避免稀释的样液不成梯度或者不均匀造成结果的偏差；④Baird-Parker琼脂平板使用前可放在培养箱内干燥，以消除平板表面的水珠，接种后应尽快涂布，避免形成菌团，涂布时L棒尽量不要涂到平板边缘造成蔓延生长；⑤血浆凝固酶试验必须同时做阳性和阴性对照，且每30 min观察1次，观察6 d。由于葡萄球菌如果产生大量的葡萄球菌链激酶可以溶解纤维蛋白凝块，误判为阴性。为降低假阴性的发生，可延长观察时间以确保试验结果的准确性[5]。

本次实验采用了两种不同接种量的方法，其检测结果相同，由广州市疾控中心审核评判检测结果为合格。在实际工作中，采用食品安全国家标准致病菌金黄色葡萄球菌的定量检测BP法接种量为0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的方法需要在不同稀释度的Baird-Parker琼脂平板上不停切换接种量，容易出现差错，而接种量0.3 mL、0.3 mL、0.3 mL的方法，操作简单，对基层实验室非仲裁检验工作具有实际意义。