表面活性素促进枯草芽胞杆菌XF-1在大白菜叶际定殖能力研究

何朋杰 崔文艳 何鹏飞 李兴玉 吴毅歆 SHAHZAD Munir 何月秋

摘要 枯草芽胞桿菌XF-1是一株大白菜内生生防菌，通过叶面喷施的方式可有效防控大白菜根肿病，但其叶际定殖的分子机制尚不明确。为了明确表面活性素对XF-1在大白菜叶际定殖的影响，进一步提高其在田间应用效果，本研究通过测定生长曲线、泳动运动、群集运动和24孔细胞培养板静置培养试验，分析表面活性素对XF-1菌株生长速率、运动能力和生物膜形成水平的影响;利用叶片-微生物互作分析和定殖试验，测定XF-1及突变体XF-1-ΔsrfA在大白菜叶表黏附和植株内的定殖能力。结果表明，XF-1-ΔsrfA与XF-1相比生长曲线没有明显差异，泳动能力和群集运动能力分别显著下降了36.8%和43.9%，静置培养24 h后生物膜形成能力显著下降53.9%，48 h后无显著差异。叶片-微生物互作试验中，突变体标记菌XF-1-ΔsrfA-gfp黏附效率较XF-1-gfp约下降80%。喷施接种3～7 d后， XF-1-ΔsrfA-gfp相较于XF-1-gfp在大白菜叶片内和根系中的定殖数量均显著下降。试验结果表明表面活性素对枯草芽胞杆菌XF-1在大白菜叶际定殖具有较为明显的促进作用，srfA基因的缺失显著抑制XF-1的叶际定殖能力。

关键词 表面活性素; 枯草芽胞杆菌; 定殖; 生长曲线; 群集运动; 生物膜

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020580

Surfactin promotes the colonization of Bacillus subtilis XF-1 in the phyllosphere of Chinese cabbage

HE Pengjie1，2#， CUI Wenyan1，2#， HE Pengfei1， LI Xingyu1， WU Yixin1， SHAHZAD Munir1， HE Yueqiu1*

（1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan， Yunnan Agricultural

University，Kunming 650201， China; 2. Faculty of Basic Medicine， Guizhou University of

Traditional Medicine， Guiyang 550025， China）

Abstract

Bacillus subtilis XF-1 strain， an endophytic biocontrol bacterium， was isolated from Chinese cabbage rhizosphere， which could effectively control clubroot disease of Chinese cabbage through foliar-spaying， but the molecular mechanisms of its colonization in the phyllosphere of Chinese cabbage are still unclear. To determine the effect of surfactin on the colonization of XF-1 in the phyllosphere of Chinese cabbage and provide theoretical instructions for improving the agricultural application of B.subtilis XF-1， the growth curves， motility and biofilm formation of strain XF-1 and mutant XF-1-ΔsrfA were analyzed through static culture and biofilm assays on swimming and swarming agars and in 24-well plates， respectively. Then， the bacterial attachment onto plant leaf surface and colonization in plant tissues of XF-1 and its mutant XF-1-ΔsrfA were checked based on leaf-microbe interaction analysis and colonization assays. The results showed that， compared to wild type XF-1， there was no significant difference in the growth curve of XF-1-ΔsrfA; the swimming and swarming abilities of XF-1-ΔsrfA were significantly reduced by 36.8% and 43.9%， respectively， and the ability of biofilm formation of mutant XF-1-ΔsrfA was significantly reduced by 53.9% after 24 h， but there was no statistical difference after 48 h. Moreover， compared with XF-1-gfp， adhesion efficacy of  XF-1-ΔsrfA-gfp  onto plant leaf surface was decreased by approximately 80% in the assay of leaf-microbe interaction. In addition， the colonization density of GFP-tagged mutant， XF-1-ΔsrfA-gfp in plant leaf and root tissues significantly declined three to seven days after spraying bacterial suspension compared to XF-1-gfp. This study suggested that surfactin had an obvious promotion effect on the colonization of XF-1 in the phyllosphere of Chinese cabbage， which was significantly inhibited when the srfA gene was knocked out.

Key words

surfactin; Bacillus subtilis; colonization; growth curve; swarming; biofilm

有益生防芽胞杆菌能够通过多种机制促进植物生长，帮助植物抵御病原菌的侵染。促生与生防作用的基础是芽胞杆菌在植株组织内的定殖数量必须达到能够发挥作用的最低数量级[1]。在植物根际，除初始接种种群数量外，土壤中的芽胞杆菌的定殖主要取决于4个关键因素：植物根系分泌物的含量和种类、细菌对植物根系分泌物的趋化性、在植物根表形成生物膜水平及群集运动能力。其中，首先发挥作用的是趋化反应和运动能力。细菌靠近或接触根表后才开始形成生物膜[2-4]，逐步完成定殖过程。植物叶际与根际的环境差异巨大，与根际环境相比，叶际微生物直接暴露于大气之中，受到自然环境的影响，同时间接受到植物代谢物的影响，生存条件极为恶劣[5]。此外，由于植物叶片存在蜡质角质层，叶际分泌物较根系分泌物含量和种类均较为匮乏，湿度和温度变化较快，外加光照、紫外线、风力等环境因子的影响[5-6]，可能使得芽胞杆菌在植物叶际的定殖模式和分子机制与根际有较大的差异。

表面活性素（surfactin）是一类脂肽类抗生素，芽胞杆菌普遍产生表面活性素。表面活性素具有的一个显著特点是减小表面张力。由于群集运动需要细菌个体之间的相互交流和作用，故表面活性素等表面活性物质的生物合成与分泌是影响细菌群集运动能力的关键因素之一[7]。表面活性素等多种脂肽类抗生素在芽胞杆菌生物膜形成过程中发挥着重要的调控作用，López等报道了表面活性素促进芽胞杆菌3610生物膜形成与钾离子泄漏有关[8]。因此，表面活性素的生物合成与分泌也是促进芽胞杆菌根际定殖的关键因素之一。然而，表面活性素是否影响内生芽胞杆菌在寄主叶际的定殖能力及相关分子机制尚不明确。

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis XF-1（CGMCC No.2357）（下称XF-1）分离自根肿病重病田的大白菜根际土壤，具有内生特性，对由芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae Woronin侵染引起的土传病害大白菜根肿病有良好的生防效果，应用潜力巨大[9-11]。本实验室的前期研究发现，叶面喷施XF-1能有效减轻大白菜根肿病的危害程度[12]，但其在葉际定殖的分子机制尚不明确。为了研究XF-1菌株在大白菜叶际的定殖模式和相关分子机制，本文以XF-1和其表面活性素缺陷突变体XF-1-ΔsrfA（不分泌表面活性素）为材料，利用群集运动试验、生物膜形成试验和盆栽条件下叶表黏附及组织内定殖能力监测试验，初步探究表面活性素对XF-1在大白菜叶际定殖的促进作用，以期为田间条件下叶面喷施XF-1防控大白菜根肿病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis XF-1和其表面活性素缺陷突变体XF-1-ΔsrfA及相应的绿色荧光蛋白（GFP）标记菌株XF-1-gfp与XF-1-ΔsrfA-gfp，均保存于本实验室。

1.1.2 供试大白菜

大白菜品种‘青岛83-1 种子购自昆明市农贸市场。

1.1.3 试剂

氯霉素购自索莱宝（Solarbio）科技有限公司（北京）;Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR试剂购自全式金生物技术有限公司（北京）;其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.1.4 供试培养基

泳动培养基：蛋白胨1%（m/V，下同），氯化钠0.25%，琼脂粉0.3%。群集培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨10%，酵母粉5%，氯化钠5%，琼脂粉06%。LB培养基：蛋白胨10%，酵母粉5%，氯化钠5%，琼脂粉2%。MSgg培养基：氯化镁2 mmol/L，氯化钙700 mmol/L，氯化铁50 mmol/L，氯化锰 50 mmol/L，氯化锌 1 mmol/L，硫铵2 mmol/L，3-吗啉丙磺酸（MOPS）溶液100 mmol/L（pH 7.0），磷酸钾缓冲液5 mmol/L（pH 7.0），甘油5%，谷氨酸0.5%，苯丙氨酸50 mg/mL，色氨酸50 mg/mL。生物膜测定漂洗缓冲液：硫酸铵 150 mmol/L，磷酸二氢钾 100 mmol/L，柠檬酸钠 34 mmol/L，硫酸镁 1 mmol/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 野生型菌株XF-1与突变体菌株的生长曲线测定

将过夜活化的细菌接种于新鲜LB培养基中，37℃，160 r/min，振荡培养4～6 h，用无菌水重悬至OD600=0.6作为种子液。按1∶100的接种量将种子液转接至装有100 mL液体LB培养基的三角瓶（500 mL）内，每个菌株设3个重复。37℃ 振荡培养，分别于转接后的0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、72 h取样，用紫外分光光度计测定波长600 nm处的吸光度。以培养时间为横坐标，各培养阶段的吸光值为纵坐标，比较XF-1和突变体XF-1-ΔsrfA在LB培养基中的生长差异。

1.2.2 野生型菌株XF-1与突变体菌株的运动性测定

运动性包括泳动运动和群集运动。将过夜活化的细菌接种于新鲜LB培养基中，37℃，160 r/min，振荡培养，直至OD600达到约1.0时，用牙签尖部蘸取细胞培养物分别转接至芽胞杆菌泳动运动和群集运动试验平板的中央。室温培养12～48 h后测定所形成的菌落直径或拍照。

1.2.3 野生型菌株XF-1与突变体菌株的生物膜测定

生物膜试验用24孔细胞培养板进行（JET BIOFIL， 海门），具体流程参照Hamon等[13]的方法稍做修改。将过夜活化的细菌接种于LB液体培养基中，37℃，160 r/min振荡培养，直至OD600达到约1.0时，4℃离心收集菌体。用无菌水洗涤菌体并重悬于与LB培养液等体积的MSgg培养基中。往细胞培养板的培养孔中加入2 mL的MSgg培养基，然后分别接种10 μL XF-1或XF-1-ΔsrfA菌悬液，各设置3个重复，于37℃静置培养。分别于培养后24 h和48 h，用枪头小心吸净生物膜下的液体培养基和游离的细胞，加入适量的漂洗缓冲液轻柔漂洗3次。室温下自然风干，加入适量含33%乙酸的1%结晶紫染液，室温染色20 min。染色结束后用ddH2O漂洗5～10次，再加入200 μL 洗膜缓冲液（33%乙酸）置于摇床上低速振荡15 min（37℃，70 r/min），稀释5～10倍后于570 nm处测定吸光度。

1.2.4 野生型菌株XF-1与突变体菌株的黏附试验

芽胞杆菌重悬液的制备：将过夜活化的GFP标记菌株XF-1-gfp与XF-1-ΔsrfA-gfp转接至液体LB培养基（含10 μg/mL氯霉素）中。37℃，160 r/min，振荡培养48 h，制得稳定期培养物。培养结束后，室温离心（2 700 g，10 min）收集菌体，然后使用0.85%的生理盐水清洗并重悬菌体细胞。芽胞杆菌重悬液现配现用。

挑取健康饱满的大白菜种子表面消毒后播种于装有灭菌自然土的营养钵（18 cm×18 cm）中。出苗20～30 d后，首先在无菌条件下去除最外面的两片子叶，随机挑取2～3片内部的真叶，用手术刀将其切成3 cm×3 cm的小块;然后将切取的大白菜小块叶片置于培养皿（d=9 cm），每个培养皿放1小块叶片，加入25 mL生理盐水，保证叶片被完全浸没;最后将整个培养皿置于30℃和高强度光照（7 500 lx）条件下预处理20 min。预处理结束后，小心移除培养皿内生理盐水，重新加入25 mL  XF-1-gfp或突变体XF-1-ΔsrfA-gfp悬浮液（108 cfu/mL），置于相同的光照条件下水浴30 min。

水浴结束后，将叶片在无菌生理盐水中连续漂洗10次以移除未黏附菌。将叶片转入研钵中快速研磨成匀浆，用梯度稀释法稀释匀浆液并涂布到含10 μg/mL氯霉素的LB固体平板上。37℃静置培养24 h，次日于光电折射仪下统计平板上的荧光菌落数。

1.2.5 野生型菌株XF-1与突变体菌株的定殖监测

大白菜栽培于营养钵（18 cm×18 cm）中，出苗10 d后，每盆保留长势一致的幼苗2株作为试验材料。参照何朋杰等[12]的方法接种XF-1-gfp、XF-1-ΔsrfA-gfp菌悬液：取适量的无菌吸水纸轻柔地包裹住幼苗茎基部至完全覆盖盆栽土壤，然后用无菌棉球蘸取菌悬液轻轻擦拭大白菜幼苗的全部叶片表面，使叶表完全润湿但不能有液滴滴下，5 min后小心移除吸水纸。本试验同时设立野生型菌株XF-1和无菌水两个对照处理，每处理种植大白菜幼苗9盆，每3盆为1组分别用于处理后第3、5、7天取样，结合选择性培养与光电折射仪，采用梯度稀释涂板法回收监测标记菌在大白菜的根以及叶组织内的定殖数量[14-15]。根系样品的采集和处理：取3盆大白菜幼苗将其中6棵苗全部从土壤中轻轻拔起，置于水龙头下轻柔冲洗后用吸水纸吸干表面水分;然后将根剪成长约 1～1.5 cm的小段，称重，经表面消毒（1%次氯酸钠溶液消毒5 min，75%乙醇消毒3 min）后在无菌条件下研磨均匀，按每克根加9 mL无菌水的比例转移至试管中;涡旋混匀后梯度稀释至10-1和10-2，取稀释液涂布于含10 μg/mL氯霉素的LB平板上，每浓度涂3个平板，37℃静置培养16～30 h，待菌落长出后置于光电折射仪下统计发光菌落数。除表面消毒时间（1%次氯酸钠溶液消毒2 min，75%乙醇消毒2 min）不同外，大白菜叶片样品（第1和第2片真叶）的采集和处理方式与根系一致。

1.3 数据分析

运用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Duncan氏新复极差法做差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 突变体菌株与野生型菌株XF-1生长的差异

为了明确srfA基因敲除后生长速度对菌株运动性与生物膜形成及叶际定殖的影响，本研究首先比较了XF-1及突变体XF-1-ΔsrfA的生长差异。如图1所示，两菌株生长曲线没有明显差异。说明在室内条件下，srfA基因的敲除不会导致菌株生长发生滞后现象。

2.2 突变体菌株与野生型菌株XF-1运动能力的差异

表面活性物质在芽胞杆菌的鞭毛运动行为中充当着“润滑剂”的作用，故表面活性素合成缺失后芽胞杆菌的运动能力极可能大幅减弱。分别接种XF-1及XF-1-ΔsrfA至泳动、群集运动平板（图2a）中。结果表明，与野生型菌株XF-1相比，表面活性素合成缺失后运动能力显著减弱，突变体XF-1-ΔsrfA泳动能力和群集运动能力分别下降了36.8%和439%（圖2b）。

2.3 突变体菌株与野生型菌株XF-1生物膜形成能力的差异

采用24孔细胞培养板静置培养和结晶紫染色的方法定量测定了XF-1及XF-1-ΔsrfA的生物膜形成能力。试验结果（图3）表明，在室内条件下，XF-1-ΔsrfA较XF-1在24 h时生物膜形成能力下降53.9%，差异显著，而在48 h时二者的成膜能力相近。表明表面活性素仅在早期（<48 h）影响XF-1生物膜的形成，且表面活性素只是调控芽胞杆菌生物膜形成的因子之一。

2.4 突变体菌株与野生型菌株XF-1叶表黏附能力的差异

为研究表面活性素对XF-1叶表黏附能力的影响，首先分别将XF-1-gfp、XF-1-ΔsrfA-gfp与新鲜大白菜叶片置于光照条件下共培养30 min （30℃），然后稀释涂板检测叶表及叶内的标记菌总数量。检测结果如图4所示，监测回收到的XF-1-ΔsrfA-gfp菌落数量约为XF-1-gfp数量的20%，XF-1-ΔsrfA-gfp黏附效率较XF-1-gfp约下降80%，表明表面活性素确实是影响芽胞杆菌在叶表黏附的关键因子。

2.5 表面活性素合成缺陷显著降低XF-1在大白菜植株内的定殖能力

为明确XF-1及其突变体XF-1-ΔsrfA在大白菜叶际定殖能力的差异，监测了目标标记菌在大白菜叶组织内的定殖数量。结果表明，与标记菌处理组相比，接种野生型菌株XF-1和无菌水后，抗性平板上均无荧光菌落生长（数据未展示）;接种标记菌株3～7 d后，菌株XF-1-gfp与突变体XF-1-ΔsrfA-gfp在叶片内定殖数量差异显著（15～62倍，图5）。

XF-1在大白菜根系内的定殖结果（图6）显示，喷施接种后第3天，根系内即检测到大量XF-1-gfp（5×102 cfu/g），但未检测到突变体菌株XF-1-ΔsrfA-gfp。接种后第5天，根系内XF-1-gfp菌落的数量达到峰值（约1.5×103 cfu/g），此后逐渐下降并在接种后第7天下降至约8×102 cfu/g;与此同时，检测到的突变体XF-1-ΔsrfA-gfp的菌落数量均显著低于XF-1-gfp，接种后第5天和第7天XF-ΔsrfA-gfp的菌落数量分别为50 cfu/g与2×102 cfu/g。上述结果表明表面活性素不仅影响XF-1在大白菜植株内的迁移速度，还影响其在植株内的种群数量。

3 结论与讨论

植物内生生防菌在防控植物病害、减少农业损失、提高农产品品质等方面发挥重要作用。枯草芽胞杆菌XF-1是本实验室从大白菜根肿病重病田的健康植株根际分离得到的一株生防菌株，能够合成分泌表面活性素、丰齐素、伊枯草菌素等次生代谢产物，因其对根肿病优异的生防效果，现已研制成100亿芽孢/g可湿性粉剂在全国范围内大面积推广应用[9-11，16-17]。有趣的是，采用叶面喷施的方式它也能定殖在植株组织内并有效防控大白菜根肿病[12]。本文中，以菌株XF-1和其表面活性素合成缺陷突变体XF-1-ΔsrfA为材料，明确了表面活性素在XF-1于大白菜叶际定殖中所扮演的角色，为进一步研究XF-1在大白菜叶际和植株内定殖机制及提高大田环境和喷施接种方式下XF-1生防效果的稳定性提供了基础。

芽胞杆菌的根际定殖与其趋化性、运动性和生物膜的形成密切相关[3-4]。表面活性素等表面活性物质一方面具有增加表面张力和起到润滑剂的作用，是细菌在介质表面黏附和群集运动必不可少的前提条件[7，18]，也间接影响了芽胞杆菌的趋化速度[18-19];另一方面通过细胞膜上的K离子通道促进生物膜的形成[8]。本研究对野生型及其突变体菌株的运动能力和生物膜形成能力分析后发现，突变体XF-1-ΔsrfA的群集运动能力较野生型菌株XF-1显著降低（低43.9%）;其成膜能力在静置培养24 h时显著低于XF-1（低539%），而培养48 h二者无显著差异。泳动运动是依赖鞭毛旋转产生的动力而行进的一种细菌运动类型，其与群集运动的区别是，泳动是细菌以单个个体在液体环境中移动。此前有研究表明表面活性素与细菌的泳动运动并无关联[7，18]。而Ghelardi等[18]发现表面活性素通过上调鞭毛蛋白的表达，促进枯草芽胞杆菌PB1831的泳动。有趣的是，本研究试验结果表明表面活性素合成缺失后，XF-1-ΔsrfA的泳动能力较野生型菌株下降了36.8%，与Ghelardi等试验结果相似，表明表面活性素不仅在XF-1的群集运动中发挥润滑作用，而且也可通过促进鞭毛的合成正向介导XF-1的泳动运动，但尚需后续的试验进一步证实。由于上述因素，表面活性素在芽胞杆菌的根际定殖中发挥着关键的作用[18]。笔者猜测XF-1在大白菜叶际的定殖与根际定殖机制相似，但因为叶际环境的特殊性，如光照、温度的变化和叶际分泌物的匮乏，导致定殖模式发生一定程度的改变[4-6]。内生微生物必须在短时间内成功黏附在叶表或快速通过气孔进入叶片内，才能有效规避外界环境中的不利条件，高效地定殖在适宜的生存环境——寄主植株内。根据微生物的根际定殖机制[3， 18-20]，表面活性素对芽胞杆菌运动能力和成膜能力的提升极可能提高内生芽胞杆菌在寄主叶表的成膜能力和进入叶肉组织的速度，从而促进其在寄主叶际的定殖能力。本文将GFP标记菌株XF-1-gfp及突变体XF-1-ΔsrfA-gfp与大白菜叶片置于光照条件下共培养30 min，结果表明，叶片表面黏附和叶内定殖XF-1-gfp的数量显著高于XF-1-ΔsrfA-gfp;接种后3～7 d，叶片内检测到的XF-1-gfp的数量显著高于突变体XF-1-ΔsrfA-gfp。

此外，微生物在寄主内的增殖速度和存活时间也在一定程度上限制其定殖的种群规模。有报道称表面活性物质合成缺失虽然不影响其在室内条件下的生长速率，但使其在与其他内生微生物的竞争中处于不利地位，使得微生物在植株内的最大种群数量大幅下降[21]。在本研究中也观察到相似的结果，随着监测回收时间点的推移，XF-1-gfp和突变体XF-1-ΔsrfA-gfp在大白菜葉片内的种群数量的差异逐渐增大。接种后3 d，根系组织中未回收到XF-1-ΔsrfA-gfp，但回收到约5×102 cfu/g的XF-1-gfp，这可能与突变体XF-1-ΔsrfA的运动能力较弱有关;接种后7 d，检测到的XF-1-ΔsrfA-gfp定殖量显著低于XF-1-gfp，再次表明XF-1-ΔsrfA在寄主组织内增殖或存活能力可能较XF-1弱。

植物内生生防菌通过多种机制帮助植物抵御外来病原微生物的侵染，如产生抗生素、抑制病原菌生长、提高植物抗逆性及高效快速定殖等。本研究中，丧失合成表面活性素能力的XF-1突变体（XF-1-ΔsrfA-gfp）接种至大白菜叶际，其在植株组织内定殖能力显著低于野生型菌株。根据本研究的结果，在后续的工作中，可以通过盆栽和大田试验对比，研究喷施接种XF-1及突变体XF-1-ΔsrfA对根肿病的防治效果，同时采用分子遗传育种的方法，过表达XF-1基因组中的表面活性素基因簇，进一步提高XF-1的叶际定殖能力，分析不同突变体对根肿病的防治效果，从而有效提高XF-1的田间应用效果，减少根肿病的发生与危害。

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（責任编辑：杨明丽）