新生儿脐血细胞因子Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4与HBV宫内感染的相关性研究

万毅，谢明月，唐云，张丽娇

（攀枝花市妇幼保健院 保健部，四川 攀枝花617000）

母婴垂直传播不仅是HBV 携带者感染的主要途径，也是肝硬化、肝细胞肝癌发生的高危因素[1-3]。现阶段临床尚未完全明确新生儿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）宫内感染的发生机制，有研究认为，细胞免疫因子失衡可能是HBV 宫内感染的主要发生机制[4]。另外，弹性蛋白酶特异性抑制物（Elafin）是妊娠期固有免疫防御系统的重要成分之一，在提高母胎抗感染防御能力方面具有一定促进作用，但其对胎儿宫内感染保护作用研究较少。基于此，本研究通过测定新生儿脐血细胞因子浓度，探讨Elafin、白细胞介素18（IL-18）、γ-干扰素（IFN-γ）/白细胞介素4（IL-4）与HBV 宫内感染的关系，阐明HBV 宫内垂直传播过程中免疫缺陷机制，为进一步抑制HBV 宫内传播研究提供免疫学理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月—2019年5月攀枝花市妇幼保健院收治的HBV 携带产妇分娩的新生儿96 例。其中，男性48 例，女性48 例；产妇年龄23～35 岁，平均（29.39±2.72）岁；胎龄36～41 周，平均（38.21±1.04）周；自然分娩45 例，剖宫产51 例。根据HBV宫内感染情况分为宫内感染组和宫内未感染组，分别为31 和65 例。另选取同期非HBV 携带且健康产妇分娩的新生儿90 例作为对照组，其中男性44 例，女性46 例；产妇年龄22～36 岁，平均（28.89±3.15）岁；胎龄35～42 周，平均（37.98±1.23）周；自然分娩42 例，剖宫产48 例。宫内感染组、宫内未感染组新生儿出生时，脐血HBV-DNA> 1.00×103copies/ml；对照组新生儿出生时，肝功能正常，且Apgar 评分均为8～10 分。3 组临床资料完整，且监护人均知情并签署同意书。排除存在妊娠期前兆流产史、先兆早产史、阴道炎、胎儿宫内窘迫或先天畸形、配偶携带HBV、妊娠期合并糖尿病、高血压者。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 Elafin水平检测收集6 ml 脐带静脉血，以3 000 r/min 离心5 min，分离取上清液，置于80℃冷库保存，采用酶联免疫吸附试验检测，试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。用重蒸水1∶20 稀释，使用前加入蒸馏水混匀，配置成溶液。设标准管，第1 管加入标本稀释液，第2～8 管加入标本稀释液。在第1 管中加入标准品溶液混匀后，吸出移至第2管，反复操作，对倍稀释，后于第7管中吸出弃去。第8 管为空白对照。10×标本稀释液以磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline, PBS）作稀释。取20 μl 待测Elafin，加入180 μl 稀释液，稀释10 倍。每孔各加入标准品或待测样品，将反应板充分混匀后稀释，并在37℃室温下放置2 h；洗板；每孔加入一抗，充分混匀反应板后37℃室温下放置60 min；洗板；每孔加100 μl 酶标抗体工作液，充分混匀反应板后37℃室温下放置30 min；洗板；每孔加100μl底物工作液，37℃室温下暗处反应15 min；每孔加100μl室温下终止液混匀，30 min 内用酶标仪检测各孔吸光度，波长为450 nm。在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，横坐标为所测标准品吸光度，纵坐标为标准品浓度值，得出直线回归方程，将样品吸光度代入方程，得出样品浓度。

1.2.2 IL-18、IFN-γ、IL-4 水平检测采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测，试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。在96 孔酶标包被板上设6 个标准品孔，标准曲线使用的质量浓度由高到低依次为25 pg/ml、50 pg/ml、100 pg/ml、200 pg/ml、400 pg/ml 及800 pg/ml，每孔加50 μl 标准品。设空白孔、待测样品孔。待测样品孔中先加50 μl 样品。除空白孔外，标准品孔、样本孔每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μl，将样品加于酶标板孔底部，轻晃混匀；封板，置37℃恒温箱温育1 h；蒸馏水与浓缩洗涤液以1∶20 稀释后备用；揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 min 后弃去，反复3～5 次，拍干；每孔加50 μl 显色剂A、50 μl 显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min；每孔加50 μl 终止液，终止反应；空白孔调零，30 min 内用酶标仪测各孔吸光度，波长为450 nm。在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，横坐标为所测标准品吸光度，纵坐标为标准品浓度值，得出直线回归方程，将样品吸光度代入方程，得出样品浓度。

1.2.3 新生儿宫内感染者HBV-DNA 载量检测新生儿出生24 h 内，在接种乙型肝炎疫苗前，抽取5 ml 外周血，以荧光定量聚合酶链反应检测HBVDNA 载量，试剂盒购自上海抚生实业有限公司。取出HBV 反应混合液，室温下融化、振荡混匀，以2 000 r/min 离心10 min。取19.4 μl HBV 反应混合液和0.6 μl Taq 酶加入离心管，混匀，以20 μl 量分装至PCR 薄壁管中。按顺序将20 μl 的阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照、定量标准品、样品洗脱液加入至反应液中，盖紧反应管。将各反应管按顺序放入荧光定量PCR 仪进行PCR 扩增：95℃预变性3 min，94℃变性5 min，先做45 个循环，最后按60℃变性30 min 再做45 个循环。

1.3 观察指标

比较3 组Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFNγ/IL-4 水平。分析新生儿HBV 宫内感染者与未感染者临床特征。比较不同HBV-DNA 载量宫内感染者脐血因子水平。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t检验或方差分析。计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验。采用多因素Logistic 回归分析新生儿HBV 宫内感染的影响因素。相关性分析采用Pearson 法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较

3 组Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），宫内感染组Elafin、IL-18、IFN-γ、IFN-γ/IL-4 水平低于宫内未感染组、对照组，IL-4 水平高于宫内未感染组、对照组（P<0.05）。见表1。

表1 3组Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较 （±s）

表1 3组Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较 （±s）

组别宫内感染组宫内未感染组对照组F 值P 值n 31 65 90 Elafin/（ng/ml）2.61±0.57 5.48±1.26 9.39±2.43 180.962 0.000 IL-18/（ng/L）32.50±7.46 126.31±28.07 153.02±32.35 211.462 0.000 IFN-γ/（ng/L）410.08±47.41 525.13±36.49 511.57±66.25 51.147 0.000 IL-4/（ng/L）628.62±70.34 571.39±62.58 560.84±65.33 12.674 0.000 IFN-γ/IL-4 0.65±0.12 0.92±0.18 0.91±0.20 27.257 0.000

2.2 宫内感染组与宫内未感染者组临床特征比较

宫内感染组与宫内未感染者组的胎龄、性别、分娩方式、胎位、产妇年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。宫内感染组与宫内未感染者组产妇HBV 大三阳、产妇羊水情况、产妇阴道流血史的比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 宫内感染组与宫内未感染者组临床特征比较

2.3 新生儿HBV 宫内感染的多因素Logistic 回归分析

以新生儿HBV 宫内感染作为因变量，以产妇HBV 大三阳、产妇羊水浑浊、产妇阴道流血史、Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4 及IFN-γ/IL-4 作为自变量，进行一般多因素Logistic 回归分析，结果显示，产妇HBV 大三阳、产妇羊水浑浊、产妇阴道流血史、Elafin、IL-18 及IFN-γ/IL-4 是新生儿HBV宫内感染的影响因素（P<0.05）。见表3。

表3 新生儿HBV宫内感染的多因素Logistic回归分析参数

2.4 相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，Elafin 与IL-18呈正相关（r=0.649，P=0.000）， IFN- γ/IL-4 与Elafin、IL-18呈正相关（r=0.529 和0.499，均P=0.000）。见图1～3。

图1 IL-18与IFN-γ/IL-4的相关性散点图

2.5 不同HBV-DNA 载量宫内感染者脐血因子水平比较

HBV-DNA 载量≥1.00×104copies/ml 与< 1.00×104copies/ml 患者分别有13 例和18 例。两组Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），≥104copies/ml 患者较< 104copies/ml患者低。见表4。

图2 Elafin与IFN-γ/IL-4的相关性散点图

图3 IL-18与Elafin的相关性散点图

2.6 脐血因子与HBV-DNA载量相关性

HBV-DNA 载量< 1.00×104copies/ml 赋值为1，≥1.00×104copies/ml 赋值为2。相关性分析结果显示，Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4与HBV-DNA载量呈负相关（r=-0.601、-0.556和-0.712，均P=0.000）。见图4～6。

表4 不同HBV-DNA载量宫内感染者脐血因子水平比较（±s）

表4 不同HBV-DNA载量宫内感染者脐血因子水平比较（±s）

HBV-DNA载量≥1.00×104copies/ml<1.00×104copies/ml t 值P 值n 13 18 Elafin/（ng/ml）2.11±0.53 2.97±0.61 4.086 0.000 IL-18/（ng/L）28.84±5.29 35.14±6.55 2.856 0.008 IFN-γ/IL-4 0.54±0.10 0.73±0.15 3.966 0.000

图4 Elafin与HBV-DNA载量的相关性散点图

图5 IL-18与HBV-DNA载量的相关性散点图

图6 IFN-γ/IL-4与HBV-DNA载量的相关性散点图

3 讨论

有研究认为，激活炎症因子与其所分泌的细胞因子在宫内抗感染免疫中起关键作用[5-7]。目前普遍认为IFN-γ/IL-4 细胞因子失衡是HBV 感染慢性化的主要因素，严重影响细胞免疫、体液免疫[8-9]。本研究结果显示，IFN-γ、IFN-γ/IL-4 在新生儿HBV 宫内感染者出现降低趋势，相反，IL-4则出现升高态势。思希尧[10]研究也证实HBV 宫内感染存在Th1/Th2 细胞失衡。进一步多因素Logistic回归分析可知，Elafin、IFN-γ/IL-4 是新生儿HBV宫内感染的保护因素。推测Th1/Th2 免疫平衡失调可能参与新生儿HBV 宫内感染发生。

IL-18 多由巨噬细胞分泌，可促使外周血单核细胞产生高水平的INF-γ，调节Thl/Th2 平衡[11]。另外经小鼠实验发现，IL-18 能诱导特异性Thl细胞应答，强化NK 细胞毒性作用，选择性促进IL-2、IFN-γ 合成，激发Thl 应答，提高机体病毒清除能力[12]。本研究发现，宫内感染组IL-18 水平明显低于宫内未感染组。任常军等[13]观点认为，IL-18 水平偏低导致机体T 细胞免疫难以被有效激活，致使INF-γ 生成含量锐减，IL-4 分泌增多，引发Thl/Th2 细胞免疫失衡，故笔者推测IL-18 与宫内感染有密切联系。同时，本研究发现IL-18 与IFN-γ/IL-4 呈正相关，说明IL-18 能强化Thl 介导的细胞免疫，有望成为HBV 宫内感染免疫治疗新靶位。因此，早期检测IL-8 水平对初步筛查HBV 宫内感染、及时应用免疫干预具有指导意义。

近年来，临床实践发现除胎盘屏障外，胎盘、胎膜及羊水中还存在Elafin 等天然抗微生物物质，对促进胎儿正常发育具有重要作用[14]。同时，国外报道还发现，Elafin 富含抗蛋白酶、抗感染活性，可能参与控制妊娠期过渡的炎症反应与组织损伤[15]。王慧华[16]通过检测新生儿Elafin 发现，Elafin在HBV 宫内感染患儿中呈异常低表达状态，支持本研究观点。Elafin 表达异常可增强蛋白酶活性，影响抗菌肽分泌，致使胎膜早破，影响天然免疫应答。本研究发现，Elafin 是新生儿HBV 宫内感染的保护因素，并与IL-18 呈正相关。推测Elafin 水平升高能降低Th 细胞对HBsAg 免疫耐受。进一步经Pearson 分析发现，Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4 与HBV-DNA 载量呈负相关。因此综合检测Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4，可为临床评估HBV宫内感染程度提供数据支持。

综上所述，Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4 在新生儿宫内感染中呈异常表达，并与HBV-DNA 载量密切相关。