基于TaqMan实时荧光PCR的拟松材线虫分子鉴定技术

宋志强，张旭君，康李鹏，王立超，周立峰，陈凤毛

(1.淳安县林业局，浙江淳安 311799；2.南京林业大学林学院，江苏南京 210037)

拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus是松属Pinus植物的寄生性线虫，广泛分布于欧亚大陆[1]。作为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的姊妹种，两者之间的亲缘关系极为接近，个体形态和生物学特性极为相似，占据着相同的生态位，并拥有相同的媒介昆虫和寄主类群[2]；两者能够杂交，产生可育杂交后代，但后代的繁殖能力相对较弱[3－4]。另外，一些拟松材线虫的虫株对松树也具有较强的致病性[5－7]。因此，拟松材线虫是公认的松材线虫病病原鉴定最为主要的干扰物种，如何区分松材线虫和拟松材线虫成为限制松材线虫病病原鉴定准确率的主要因素。

当前，国内外对于松材线虫病病原鉴定大多采用形态学和分子生物学技术。形态学鉴定主要根据雌性成虫的尾尖突长短来区分松材线虫和拟松材线虫[8－9]，但由于个体之间存在一定的差异，往往导致没有丰富种类鉴定经验的检验人员难以准确识别[10]。另外，由于取样量和取样季节等因素的影响，从松木样品中分离出来的线虫数量过少或找不到雌性成虫等情况时有发生，妨碍了形态学鉴定。随着生物技术的发展，分子技术已经成为松材线虫物种鉴定的常用辅助手段之一，但由于松材线虫和拟松材线虫的亲缘关系十分接近，假阳性现象偶有发生，错误地将拟松材线虫鉴定为松材线虫。因此，在研究松材线虫分子检测与鉴定技术的同时，开发拟松材线虫分子鉴定技术，构建可疑线虫双重检测的分子鉴定技术体系，对于提高松材线虫种类鉴定准确性具有十分重要的意义，同时也能够为拟松材线虫本身的系统发育等基础生物学研究奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 供试线虫 供试的30株拟松材线虫和10株松材线虫均由南京林业大学森林保护研究所提供，其寄主和来源详见表1。将各线虫株系转接到长满灰葡萄孢Botrytis cinerea的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，25℃条件下培养5～7 d，待灰葡萄孢菌丝被取食殆尽时，采用贝尔曼漏斗法收集线虫[11]，备用。将收集到的线虫移至无菌水的平皿中，静置10 min后，弃上清，卵因为有粘性留在平皿的底部。在显微镜下观察，用移液枪吸取获得单个卵或单条线虫。

表1 供试线虫的寄主及来源Tab.1 Geographic origins and host species of the nematode isolates

1.2 DNA提取 线虫样品用无菌水洗涤3～5次后，分别取40 μL(约1 000条)置于Eppendorf管中，加入 40 μL 线虫裂解液(125 mmol/L KCl，25 mmol/L Tris－HCl，pH 8.3，3.75 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L DTT，1.125%Tween20，0.025% gelatine)，加入 2 μL 蛋白酶 K(200 mg/mL)，混匀，在65℃水浴中保持45 min，后95℃ 15 min；12 000 r/min离心3 min，取上清液；用 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Nanochip测定 DNA的浓度，－20℃备用。对于单条线虫及单卵则采用10 μL体系的冻融法提取DNA[12]。

1.3 引物与TaqMan探针设计 从GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下载39种线虫的核糖体DNA ITS。其中，伞滑刃属Bursaphelenchus 36 种:B.mucronatus，B.xylophilus，B.hellenicus，B.rainulfi，B.thailandae，B.hofmanni，B.abietinus，B.anamurius，B.antoniae，B.arthuri，B.borealis，B.braaschae，B.clavicauda，B.conicaudatus，B.corneolus，B.eggersi，B.eremus，B.fungivorus，B.gerbera，B.hildegardae，B.hylobianum，B.okinawaensis，B.paracorneolus，B.paraparvispicularis，B.parathailandae，B.pinasteri，B.pinophilus，B.platzeri，B.poligraphi，B.seani，B.sexdentati，B.sinensis，B.tusciae，B.vallesianus，B.willibaldi，B.yongensis；长尾滑刃线虫属 Seinura 2种:S.lii和S.wuae；滑刃线虫属 Aphelenchoides 1种:A.macronucleatus。采用BioEid软件(V7.2)对供试线虫的核糖体DNA ITS进行比对，在碱基差异较多的区域利用Primer Premier 5软件设计拟松材线虫的引物和TaqMan荧光探针。

1.4 TaqMan探针特异性检测 验证拟松材线虫核糖体DNA ITS引物与探针的特异性，对30株拟松材线虫和10株松材线虫分别进行TaqMan实时荧光PCR。实时荧光PCR仪为ABI SepOnePlus Real-Time PCR System 7500。 反应总体积为10 μL，Premix Ex TaqTM(2 ×)5 μL，引物各0.25 μL，探针 0.5 μL，蒸馏水2.5 μL，DNA 模板1.5 μL。 反应程序为50 ℃ 2 min；随后95℃ 15 s，35个循环；最后60℃ 20 s。

1.5 引物扩增效率分析 分析拟松材线虫核糖体DNA ITS引物TaqMan实时荧光PCR的扩增效率，将拟松材线虫DNA进行10倍法梯度稀释5个浓度梯度后进行 TaqMan实时荧光 PCR，反应体系同1.4，获得各梯度浓度的循环数值(threshold cycle values，Cq)。根据各梯度浓度及相应的Cq值绘制扩增标准曲线，得到线性方程，并通过斜率法计算出引物的扩增效率(Amplification efficiency，E)[13]。

1.6 探针灵敏度检测 采用1.2方法所提取的单条线虫和单个卵的DNA进行TaqMan实时荧光PCR，反应体系同1.4，分析拟松材线虫核糖体DNA ITS引物TaqMan实时荧光PCR，检测拟松材线虫的灵敏度。

1.7 统计分析 TaqMan实时荧光PCR反应均设有3个技术重复和3个生物学重复，并设有1个阴性对照。扩增效率E＝(10－1/S－1) ×100%，S为扩增标准曲线的斜率。相关系数(R2)通过扩增标准曲线回归计算获得[12]。数据统计分析使用Microsoft Excel 2007软件。

2 结果与分析

2.1 拟松材线虫特异性引物与TaqMan探针设计从GeneBank上下载的39种滑刃属、伞滑刃属和长尾滑刃线虫属线虫的核糖体DNA ITS，通过多重序列比对，发现在核糖体DNA ITS2存在较多的差异碱基(表2)。

表2 拟松材线虫特异性TaqMan实时荧光PCR引物与探针设计Tab.2 Designing of special TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

2.2 拟松材线虫特异性引物与TaqMan探针验证对30株拟松材线虫和10株松材线虫分别进行TaqMan实时荧光PCR结果显示，拟松材线虫虫株均检测到了Cq值(20.2±0.7)，而松材线虫虫株均没有检测到Cq值，表明所设计的拟松材线虫核糖体DNA ITS引物与探针具有特异性。

2.3 拟松材线虫特异性引物扩增效率 对拟松材线虫核糖体DNA ITS引物的扩增效率曲线(图1A)线性回归分析，得到扩增效率方程y＝－3.43x＋20.91(图1B)，再根据斜率计算出扩增效率E＝96%。拟松材线虫核糖体DNA ITS引物的扩增效率为90%～105%，表明该引物能够稳定地扩增基因序列。

图1 拟松材线虫特异性TaqMan实时荧光PCR引物扩增效率分析Fig.1 Amplification efficiency of the TaqMan real-time PCR for B.mucronatus

2.4 拟松材线虫特异性引物与TaqMan探针灵敏度 所有参与TaqMan实时荧光PCR反应的生物学重复和技术重复均得到了稳定的Cq值(表3)，说明所设计的拟松材线虫核糖体DNA ITS引物与探针具有较高的灵敏性。

表3 拟松材线虫TaqMan实时荧光PCR引物与探针灵敏度分析Tab.3 Sensitivity of the TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

3 结论与讨论

松材线虫病是世界范围内有历史记载以来最为严重的森林病害，对我国及多个国家的松林带来巨大破坏，造成极其严重的经济和生态损失。因此，松材线虫被许多国家列为一级检疫对象。借助现代分子生物学技术，开发特异性强、灵敏度高的分子检测和鉴定技术成为近年来松材线虫快速检测技术研究的前沿和热点[14]。然而，由于松材线虫与拟松材线虫的亲缘关系过于接近，检测结果可能会出现一定的假阳性，造成鉴定结果不准确。本研究瞄准松材线虫种类鉴定的主要干扰物种拟松材线虫，基于TaqMan实时荧光PCR技术开发出一套可用于拟松材线虫分子鉴定的特异性引物和探针，结合已有的松材线虫分子检测与鉴定技术，可以构建起可疑线虫双重检测分子鉴定技术体系，为进一步开发实用有效的检测新设备奠定基础，在研究思路上具有一定的创新性。研究结果表明，该技术灵敏度高，可以实现对单条拟松材线虫甚至单个卵的检测和鉴定，对排除拟松材线虫的干扰和提高松材线虫种类鉴定的准确性具有十分重要的意义。与此同时，本研究结果也能够为深入开展拟松材线虫本身的系统发育和进化生物学等基础理论研究提供坚实的基础。

随着分子生物学研究的飞速发展，多种分子技术开始应用于线虫的检测和鉴定。张立海和赵立荣等[15－16]以松材线虫ITS1区域上的特异性引物5′－GATGATGCGATTGGTGACT－3′、拟松材线虫ITS1区域上的特异性引物5′－TGCGCTGCGTTGAGTCGA－3′为正向引物，以5.8S区域上的松材线虫和拟松材线虫的通用引物5′－CAATTCACTGCGTTCTTC－3′为反向引物进行PCR扩增，结果松材线虫扩增的片段长度329 bp，拟松材线虫扩增的片段长度206 bp，而其他滑刃线虫与真滑刃线虫则无扩增产物。陈凤毛等[17]应用随机扩增多态性DNA标记(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技术筛选出OPC18、OPN18引物组合，在拟松材线虫株系中扩增出一条970 bp特异性片段，能准确地鉴定拟松材线虫。Urek等[18]认为限制性内切酶片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)可用于区分多种滑刃属线虫和伞滑刃属线虫；但陈凤毛等[19]认为RFLP会产生大量长度相近的酶切片段，导致这种技术不适合大量样品的快速检测和鉴定；而Filipiak等[20－21]进一步证实基于实时荧光PCR技术可以用于区分松材线虫与拟松材线虫。另外，小亚基(Small subunit，SSU)[22]、大亚基(D2/D3 domain of large subunit，D2/D3 LSU)[23]和线粒体COI基因(Mitochondrial cytochrome oxidase I，mtCOI)[24]等均可被用于线虫的种类鉴定。本研究基于实时荧光PCR技术，针对线虫遗传多变区核糖体DNA ITS设计拟松材线虫特异性的引物和TaqMan探针组合，该组合经验证具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点，能够为林业和海关检疫提供有力的技术支撑。