miR-23-3p及靶基因TIGIT在寻常性银屑病患者外周血单个核细胞的表达

王菲菲，孙丽蕴，白彦萍

银屑病是一种T淋巴细胞介导的慢性复发性炎症性皮肤病，多基因背景与环境因素相互作用所导致的免疫失衡是其发病的主要原因。患者的皮损表现、疾病严重程度以及病程均存在不同程度的差异，但也给患者带来沉重的经济和精神负担[1]。microRNA（miRNA）是一类在动植物及病毒中广泛存在的长度一般为19～25个核苷酸组成的单链小分子非编码RNA，通过基因切割和翻译抑制的方式直接调控基因组中30%以上的蛋白编码基因的表达[2]，调节机体免疫反应、细胞增殖、分化和凋亡参与银屑病发病过程[3]。本研究通过检测银屑病患者外周血单个核细胞（PBMC）中差异表达的miRNA，并预测其靶基因，研究其在银屑病中的作用机制[4,5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 选取2016年2—12月在中日友好医院就诊的寻常性银屑病患者15例，其中男10例，女5例，年龄18～65岁，平均年龄（37.5±7.5）岁，病程1～20年，平均病程（8.1±5.5）年。所有患者近3个月未进行过系统治疗，且无其他免疫系统疾病。同期选体检中心健康者14例，男8例，女6例，平均年龄（38.1±9.4）岁，与银屑病组患者在性别、年龄等一般资料方面无差异。银屑病组中选取5例患者的样本、健康对照组中选取4例健康者的样本用于芯片检测。

1.1.2 主要试剂和仪器 Trizol试剂（美国Invitrogen公司），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo公 司），FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche公司），RNA洗脱纯化试剂盒（美国Qiagen公司），MirVanaTMmiRNA分离试剂盒（美国Ambion公司），Human miRNA Microarray，Release 21.0，8×60K芯片（Agilent公司），本实验芯片部分在北京博奥晶典完成，其他相关试剂均由该公司提供。Agilent芯片扫描仪（G2565CA），荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有研究对象均采集外周静脉血6 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，利用Ficoll淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法对PBMC进行提取。

1.2.2 miRNA芯片流程 ①总RNA提取；②总RNA质检；③总RNA的去磷酸核、标记和杂交；④芯片的清洗和扫描；⑤数据提取和分析，使用Agilent Feature Extraction软件对杂交图片进行分析，并提取数据。使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析，遂采用R-Project统计软件筛选差异表达的miRNA，再应用TargetScan、DIANA、miRanda数据库，对可能靶基因进行预测，以及进行GO分析和KGEE Pathway分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR（real-time-PCR）检测PBMC中TIGIT mRNA的表达：①CD4+T淋巴细胞总RNA的抽提；②RNA质量的检测；③RNA逆转录为cDNA；④PCR扩增实验：TIGIT引物： sense：GACTTGGGGTGGCACATCTC，anti-sense：AATGGAATCTGGAACCTGGCA；肌动蛋白内参引物：sense：CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT, antisense：CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC。

1.3 统计学方法

使用Agilent GeneSpring 软件对数据进行归一化，用SPSS20.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）形式表示，符合正态分布采用t检验或方差分析进行检验，非正态分布采用Mann-Whitney非参数U检验。相关性分析使用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA质量鉴定

分光光度计分析RNA的浓度和纯度。9例患者RNA纯度：A260/280≥1.70符合表达谱芯片实验要求；总量≥1 µg，满足表达谱芯片实验要求。RNA完整性质量基本符合表达谱芯片实验要求（表1）。

表1 样本总RNA定量结果

2.2 银屑病组和健康对照组PBMC差异表达的miRNA

筛选出268个表达异常的miRNA。正常人与银屑病患者PBMCs中有51个miRNAs呈差异性表达（Log FC＞1或Log FC＜-1）。结果显示有10个明显上调，41个明显下调，其中miR-23-3p等11个具有统计学差异（P＜0.05）（表2）。

表2 银屑病患者与健康对照组差异miRNAs比较

2.3 差异表达的miRNA（miR-23b-3p）分析

使用DIANA进行通路富集分析。GO分析显示miR-23b-3p参与了细胞间信号传递过程、免疫应答过程、表皮生长因子受体信号传递过程等（图1）；KEGG 通路分析提示miR-23b-3p参与T淋巴细胞、B淋巴细胞受体信号通路、MAPK信号通路等（图2），这些通路均参与了银屑病的发病过程。并且通过TargetScanHuman对靶基因预测后，发现TIGIT是其重要的靶基因（ENST00000486257.1）。靶基因表达验证TIGITmRNA在银屑病患者外周血PBMC表达显著低于健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 miR-23b-3p GO分析

图2 miR-23b-3p KEGG 通路分析

2.4 TIGIT 在PBMC中的表达

靶基因表达验证TIGITmRNA在银屑病患者PBMC表达显著低于健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 TIGITmiRNA在PBMC中的表达 （x¯ ±s）

3 讨论

银屑病一种以全身免疫失衡为特点的炎症性皮肤病，可累及患者的皮肤和（或）关节，发病总人群约占全球总人数的5%[6]，对患者的生活质量有严重的负面影响。银屑病是一种复杂的多因素疾病，其发病机制尚不清楚。目前普遍认为银屑病的病因与遗传易感性、环境以及与患者性别和年龄因素有关。其中表观遗传学可以与环境相互作用影响易感基因表达，通过作用于表皮的分化和增殖、免疫和炎症反应、细胞周期和凋亡及干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α信号通路的多基因表达参与银屑病的发病过程[7]。特别是基因调控的异常表达miRNAs，被认为是银屑病的重要致病因素。

miRNAs的表达水平在不同组织和不同发育阶段具有显著差异。包括发育进程，造血过程，器官形成，细胞增殖、分化、代谢和凋亡等。miRNA通过与信号通路和调控因子相互作用形成了一个全方位、多层次的网络调控系统，进而实现了对机体免疫平衡和表皮稳态的调控[8]。Sonkely等[9]报道miRNA-20、miRNA-146在银屑病患者皮损中表达增加，可通过作用于靶基因SOCS3、TARF6和IRAK1的表达，调控STAT-3和TNF-α信号通路，影响角质形成细胞的增殖、分化以及体内的免疫应答，参与银屑病的发生发展。Jinnin[10]通过研究银屑病患者血清中异常表达miRNAs组的交联关系，首次提出miRNAs组合表达情况可以作为银屑病可靠的诊断指标。笔者通过筛选银屑病患者差异表达的miRNA，发现miR-23-3p在银屑病患者PBMC中呈低表达状态。同时查阅文献发现miR-23-3p在多种肿瘤组织中表达增高[11]，提示其可能具有免疫抑制的作用或参与调节体内免疫抑制过程。本文通过对miR-23-3p进行GO和KEGG通路分析，发现其可能参与机体多种免疫活动，尤其是T淋巴细胞受体与其配体间的信号转导。通过对miR-23-3p靶基因进行预测，TIGIT作为具有免疫抑制作用的共抑制受体引起笔者的重视，进一步用实时荧光定量PCR定量分析后验证了TIGIT在银屑病患者确实呈低表达状态。

TIGIT作为T淋巴细胞的协同信号分子，可以通过直接抑制T淋巴细胞的活化、与抗原提呈细胞（APCs）上的CD155结合等直接或间接调节Th1/Th17对自身抗原及炎性因子发挥免疫抑制作用。因此笔者推测通过干预miR-23-3p使银屑病患者T淋巴细胞TIGIT表达增高，可能在银屑病的治疗中具有一定的潜在价值。提示miR-23b-3p可能是其潜在的治疗靶点，但其具体机制仍值得进一步探讨和研究。