冬凌草叶提取物对不同菌种生长抑制作用研究

阳 霞，韦露萍，陈子豪，陈婉婷，赵永清，2

（1.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124）

冬凌草（Rabdosia rubescens）又名冰凌草、延命草、彩花草等，唇形科香茶菜属植物，阳性耐阴植物，略喜阴，抗寒性强，能耐-20 ℃低温，10～40 ℃适宜生长，温度低于5 ℃基本停止生长。萌蘖力强，耐干旱、瘠薄，即使夏季土壤含水量低于4%，冬凌草仍能够生长。适应性强，对土壤要求不高，土层深厚、土壤肥沃、砂质壤土[1-2]、pH值 6.5～8.0，冬凌草生长最佳。花期8—10月，盛花期9月。在我国河南、山西、河北、湖南、湖北、四川、贵州、广西、云南、陕西等地均有分布，主产地在河南济源太行山一带，最早收载于《救荒本草》[3-4]。冬凌草味甘苦、性微寒，具有清热解毒、消炎止痛及抗肿瘤等作用[4-9]。冬凌草中含有二萜类、三萜类、多糖、生物碱类、黄酮、挥发油、内酯、有机酸等化学成分，二萜类成分中冬凌草甲素和冬凌草乙素研究最多。冬凌草甲素呈淡黄色针状结晶，熔点248~250 ℃，微溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。冬凌草乙素在常温常压下呈白色结晶粉末状，溶于甲醇、乙醇，微溶于石油醚，几乎不溶于水，在室温下稳定性较好。药理试验表明，冬凌草具有清热、解毒、消炎等作用，如冬凌草醇剂对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌有明显的抑制作用以及抗炎、免疫增强作用；冬凌草对治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤等具有很好的作用，此外具有较好的抗癌、抗肿瘤活性，对食管癌、贲门癌有很好的疗效，且毒性较低[10-11]。

目前，国内外关于冬凌草的抗菌活性研究范围并不广泛，主要集中在提取物[3，12]方面，关于抗菌活性成分的研究很少，主要研究了冬凌草甲素、冬凌草乙素和水杨酸等对细菌及植物源真菌的抑制作用。李小霞[13]以7种植物源真菌为研究对象，对冬凌草提取物抑菌活性及抑菌机制进行初步研究，发现冬凌草提取物可能是通过破坏细胞膜通透性，同时导致细胞代谢紊乱，从而使菌体生长受到抑制。李高申等[14]通过体外抑菌试验，发现冬凌草甲素、阿魏酸和水杨酸对3种金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性。缪玉佳等[15]对冬凌草甲素对嗜水气单胞菌体外抑菌效果及作用机制进行研究，发现冬凌草甲素对嗜水气单胞菌具有较强的抑制作用，抑菌机制主要是通过增加细胞膜的通透性以及干扰蛋白质代谢进而抑制细菌的生长繁殖。纠敏等[16]对冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制进行研究，发现冬凌草甲素是通过改变菌体细胞膜的通透性、抑制菌体蛋白质合成及代谢酶的活性从而发挥抑制作用。王大海等[17]研究表明，冬凌草甲素能够抑制植物病原真菌的生长，主要是通过对菌丝生长和孢子的抑制来实现的；冬凌草甲素对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，其对革兰氏阴性菌的作用比革兰氏阳性菌的作用弱。许美秋[18]研究了冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响，发现冬凌草甲醇提取物对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，其MIC为125 μg/mL，当冬凌草提取物质量浓度大于1 MIC时，能显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成和胞外多糖的合成。冬凌草提取物的亚抑制质量浓度可通过抑制菌体蛋白质的表达从而降低其蛋白质的表达量。宋发军等[19]对巴东冬凌草水提物抑菌效果进行研究，发现巴东冬凌草水提物有广谱抑菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均抑制，但对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌。前期研究主要集中在金黄色葡萄球菌，鉴于此，为综合利用冬凌草的药效价值，以河南省济源市冬凌草叶提取物为试样，分析其对葵肠杆菌、地衣芽孢杆菌等几种常见细菌的抑菌活性，为冬凌草叶提取物制备成抑菌制剂提供试验依据和理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

冬凌草叶样品采于河南济源；大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿 脓 杆 菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌（Salmonella）、地 衣 芽 孢 杆 菌（Bacillus licheniformis）、葵 肠 杆 菌（Enterobacter cepacius）由西北民族大学生命科学与工程学院实验室提供。

1.2 仪器与设备

试验仪器及设备相关信息见表1。

表1 试验仪器及设备

1.3 试验方法

1.3.1 冬凌草叶提取物制备 冬凌草叶提取物采用回流提取法[20-24]制备。将干燥冬凌草叶粉碎，称取粉碎的冬凌草叶20 g，放入回流装置的提取瓶中，加入95%的乙醇500 mL，在78 ℃下回流提取1 h，过滤。以45 ℃旋转蒸发仪浓缩滤液回收乙醇，制得浸膏。浸膏经电热恒温水浴锅蒸发制成固体粉末。提取工艺流程如图1所示。

图1 冬凌草叶提取物制备工业流程

1.3.2 滤纸片制备 用打孔器将滤纸打成直径8 mm的圆纸片，分装为2组，经121 ℃高压蒸汽锅灭菌30 min，置37 ℃恒温烘干备用。

1.3.3 LB培养基制备 称取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、琼脂粉15 g于950 mL蒸馏水中，调节pH值至7.0。加蒸馏水定容至1 L，加热溶解琼脂粉，121 ℃高压蒸汽锅灭菌30 min。

1.3.4 抑菌活性测定

1.3.4.1 菌悬液的制备 取出-80 ℃冰箱下冻存的7 种菌株，解冻，分别划线接种在LB培养基上，置于恒温培养箱37 ℃倒置培养24 h。待长出单菌落，用灭菌牙签挑取生长较好的菌落于液体LB培养基中摇床培养12 h（120 r/min、37 ℃），制得悬液，备用。

1.3.4.2 涂菌 取制备的供试金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、葵肠杆菌、地衣芽孢杆菌和绿脓杆菌悬液，接种100 μL于平板培养基，涂布棒涂匀。

1.3.4.3 抑菌圈直径测定 采用滤纸片法[25-27]测定抑菌圈直径。取冬凌草叶乙醇提取物，用无菌纯水复溶为0.161 g/mL。将灭菌干燥的滤纸片放入溶液中浸泡24 h，用无菌镊取出，放置于含菌平板中心。同时以浸泡在蒸馏水中的滤纸片为空白对照组，恒温培养箱37 ℃倒置培养24 h，取出观察，测量抑菌圈直径。

1.4 冬凌草叶乙醇提取率计算

对得到的试样品进行称质量，通过下式计算提取率：

2 结果与分析

2.1 冬凌草叶提取率

冬凌草叶提取率按照1.4中的公式进行计算：

冬凌草叶提取率为8.05%。

2.2 冬凌草叶提取物对细菌活性的抑制

冬凌草叶乙醇提取物的抑菌活性定性分析是利用浸过冬凌草叶提取物的滤纸片，在含菌平板中扩散，使其周围细菌的生长受到抑制，进而形成透明的抑菌圈，根据抑菌圈直径判定提取物的抑菌效果，结果如图2—8及表2所示。

图2 冬凌草叶提取物对大肠杆菌的抑菌作用

图3 冬凌草叶提取物对葵肠杆菌的抑菌作用

图4 冬凌草叶提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌作用

图5 冬凌草叶提取物对沙门氏菌的抑菌作用

图6 冬凌草叶提取物对地衣芽孢杆菌的抑菌作用

图7 冬凌草叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

图8 冬凌草叶提取物对绿脓杆菌的抑菌作用

与空白组相比，冬凌草叶提取物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌5 种供试菌均有一定的抑菌作用，含菌平板均形成了明显的透明圈，其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的透明圈相对较大，菌体生长均匀；枯草芽孢杆菌和沙门氏菌所形成的透明圈大小其次，菌体生长较为均匀；绿脓杆菌形成的透明圈较小，菌体生长不均匀；葵肠杆菌和地衣芽孢杆菌没有明显透明圈形成。综上，冬凌草叶提取物对大多数细菌有较明显的生长抑制作用，有望开发成天然抑菌制剂。

由表2可知，当冬凌草叶提取物质量浓度为0.161 g/mL时，对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用，抑菌圈直径分别为21、16、13、23、17 mm。判定标准：抑菌圈直径大于15 mm为高度敏感；10～15 mm为中度敏感；7～9 mm为低度敏感；小于7 mm为不敏感[28]。因此，本研究中上述5株供试菌对冬凌草叶乙醇提取物均呈现出中高度敏感性，葵肠杆菌、地衣芽孢杆菌对冬凌草叶提取物均不敏感。冬凌草叶提取物可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌5株供试菌的生长，且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳。综上，冬凌草叶提取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果，且对革兰氏阳性菌的抗菌活性整体上高于革兰氏阴性菌，这与参考文献[17]、[19]的报道一致。

表2 冬凌草叶提取物对7种菌的抑菌圈大小

3 结论与讨论

随着抗生素和磺酰胺及其他抗菌药物的广泛使用，细菌对药物的抵抗力不断提高。因此，研发高效、广谱和低副作用的药物将成为预防和治疗细菌感染类疾病的重中之重。研究发现，中药或天然植物提取物可抑制或直接杀灭病原菌而不产生耐药性，因此，抗菌中药逐步成为研究热点[29]。前期研究发现，冬凌草甲素药理作用广泛，可以抑制多种细菌如金黄色葡萄球菌的生长繁殖[3，30-32]。本研究主要对冬凌草叶活性物质的抑菌效果进行探索，以促进冬凌草叶更为全面的开发利用。

本研究探索了冬凌草叶提取物对7种细菌生长的抑制作用，发现冬凌草叶提取物作用质量浓度为0.161 g/mL时，对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有明显的生长抑制作用，对葵肠杆菌和地衣芽孢杆菌没有抑菌活性。冬凌草叶提取物对不同细菌的抑制效果有较明显差异。冬凌草叶提取物对革兰氏阳性菌的生长抑制程度整体上高于革兰氏阴性菌，这主要是由于不同细菌细胞壁化学组成和结构上的差异。革兰氏阳性菌的细胞壁是由多层网状结构的肽聚糖和磷壁酸组成，胞外没有脂膜，冬凌草叶提取物的有效成分可以相对容易地渗透进入，对生物膜发挥清除和形成抑制作用，致使膜壁分离，形成空腔，破坏细胞结构，从而抑制细菌的生长和繁殖。而革兰氏阴性菌的细胞壁不含磷壁酸，只含单层肽聚糖，且肽聚糖外覆着1 层脂膜，由于脂膜的存在，冬凌草叶提取物水溶性成分相对不易进入。因此，冬凌草叶提取物对革兰氏阳性菌有更显著的抑制作用。冬凌草叶提取物对多种细菌有显著的生长抑制作用，可作为植物源天然抑菌剂，安全性高，而且抑菌效果佳，可以考虑逐步取代抗生素类药物，减少抗生素滥用现象。

细胞膜保护细胞内环境相对稳定，可与外界环境进行物质、能量和信息交换。冬凌草提取物使细胞膜的形成受到抑制，通透性增加，细胞质外流，严重影响菌体的新陈代谢活动[33]。有研究表明，冬凌草甲素的抑菌机制主要通过破坏菌体形态，改变细胞膜的通透性以及引起细菌的代谢紊乱来抑制细菌生长[13，15]。冬凌草叶提取物对细菌的生物膜有清除和抑制形成作用，可抑制胞外多糖合成[18]。目前，对于冬凌草叶提取物抑菌机制的研究尚不充分，下一步将探明冬凌草叶提取物对不同病原菌的抑菌活性和抑菌机制。