全缘叶绿绒蒿总黄酮和总生物碱的提取工艺研究

余迎香，王 岩，刘明珠，暨迪军，卢永昌，2

（1.青海民族大学 药学院/青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室/青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007；2.青海省现代藏药创制工程技术研究中心，青海 西宁 810007）

全缘叶绿绒蒿［Meconopsis integrifolia(Maxim.)Franch.］属于罂粟科绿绒蒿属植物，1年至多年生草本植物。生长于高海拔地区的灌木丛或者树林下，分布于我国甘肃、青海、云南、四川、西藏等地[1-2]。全缘叶绿绒蒿为藏药材的一种，具有抗疲劳、抗氧化、止痛和保肝作用，还可治疗皮肤病[3-4]。全缘叶绿绒蒿含有生物碱类、黄酮类、挥发油等成分[5-6]，其中，生物碱和黄酮类为主要成分。生物碱多具有药物活性，为药用植物有效成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛等作用[7]。黄酮是一类含有氧杂环的化合物，多存在高等植物及蕨类植物中，具有抗氧化和抗炎功效，并能减缓肿瘤形成[8]。

1 材料和方法

1.1 试验仪器

试验所用仪器：可见分光光度计（722E，上海光谱仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-6，金坛市杰瑞尔电器有限公司）、循环水式多用真空泵（SHB-B88，郑州长城科工贸有限公司）、旋转蒸发仪（EYELA-N1100，上海爱明仪器有限公司）、电子天平（ME2353，北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 试验试剂

试验所用试剂：罂粟碱对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：171214-201205）、芦丁对照品（都莱生物有限公司，批号：N1811260038），硝酸铝、亚硝酸钠、95%乙醇、氢氧化钠均为分析纯。

1.3 供试材料

全缘叶绿绒蒿于2018年8月采自于青海省玉树市，经青海民族大学卢永昌教授鉴定为罂粟科绿绒蒿属全缘叶绿绒蒿，标本存于青海民族大学药学院标本室。

1.4 试验方法

1.4.1 总黄酮的提取工艺优化

1.4.1.1 对照品溶液制备 称取芦丁对照品10 mg，用60%乙醇100 mL溶解，得到0.1 mg/mL的对照品溶液，备用。

1.4.1.2 供试品溶液制备 在圆底烧瓶中加入1.0 g全缘叶绿绒蒿粗粉，再加入25 mL 60%乙醇，称量总质量。回流提取1.5 h，再次称量总质量，并用60%乙醇补至25 mL，过滤后得到供试品溶液。

1.4.1.3 标准曲线绘制 取6支10 mL容量瓶分别加入芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，然后用60%乙醇定容至刻度，得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的对照品溶液。分别取上述用60%乙醇定容后的不同质量浓度的对照品溶液2.0 mL至25 mL容量瓶中，再加入5%硝酸钠、10%硝酸铝溶液各1.0 mL，充分振荡后静置10 min。待混合液混合均匀后，加入60%乙醇定容，测定其吸光度[9]。以吸光度（A）为纵坐标、对照品质量浓度（C）为横坐标作标准曲线，得到线性回归方程：A=2.946 4C+ 0.007 1，r=0.999 8。

1.4.1.4 单因素试验考察 乙醇的体积分数对全缘叶绿绒蒿总黄酮提取的影响：取6个圆底烧瓶，分别加入全缘叶绿绒蒿粗粉1.0 g，再分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，回流2 h，之后用1.4.1.3中的方法测定其含量。

提取时间对全缘叶绿绒蒿总黄酮提取的影响：取5个圆底烧瓶，精确加入全缘叶绿绒蒿粗粉1.0 g，用60%乙醇进行回流提取。提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，用1.4.1.3中的方法测定含量。

液料比对全缘叶绿绒蒿总黄酮提取影响：在4个圆底烧瓶中精确加入全缘叶绿绒蒿粗粉1.0 g，用60%乙醇回流提取，液料比分别为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，用1.4.1.3中的方法测定其含量。

1.4.1.5 响应面法优化试验 试验设计及结果见表1—2。

表1 响应面法水平设计

表2 响应面法试验设计方案及结果分析

1.4.2 总生物碱的提取工艺优化

1.4.2.1 对照品溶液制备 称取罂粟碱对照品30 mg，加0.1 mol/L盐酸溶液100 mL溶解，配制成质量浓度为0.3 mg/ mL的盐酸罂粟碱溶液。

1.4.2.2 供试品溶液制备 在锥形瓶中加入已经称量好的2.0 g全缘叶绿绒蒿粗粉，加入10 mL浓氨水进行碱化处理。再加入50 mL无水乙醇，充分超声混合后，将滤液水浴蒸干，待残渣用盐酸溶解后即成。

1.4.2.3 标准曲线绘制 取6支250 mL分液漏斗，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL对照品溶液。继续加入5.0 mL醋酸盐溶液、2.0 mL溴甲酚溶液，混合均匀后再加入20 mL氯仿溶液，振荡后静置2 h。取氯仿层在416 nm下测定吸光度[10]。以吸光度A为纵坐标，罂粟碱质量浓度C为横坐标作标准曲线，得到线性回归方程：A=1.700 8C+0.010 3，r=0.998 0。

1.4.2.4 单因素法提取总生物碱 （1）不同功率对生物碱提取的影响：在锥形瓶中加入2.0 g全缘叶绿绒蒿粗粉，量取10 mL浓氨水碱化处理，搅拌使其混合均匀，静置30 min。加入60 mL无水乙醇，分别以不同功率的微波（60、90、120、150 W）回流提取2 h。再将提取液进行水浴蒸干，用0.1 mol/L的盐酸溶液溶解，按1.4.2.3中的方法测定含量。（2）温度对生物碱提取的影响：在4 个250 mL圆底烧瓶中分别加入2.0 g全缘叶绿绒蒿粗粉，量取10 mL浓氨水碱化处理，搅拌使其混合均匀。设置温度分别为40、60、80、100 ℃，加入50 mL无水乙醇回流提取2 h，最后将提取液水浴蒸干，用0.1 mol/L的盐酸溶液溶解后，按1.4.2.3中的方法测定含量。（3）液料比对总生物碱提取的影响：在锥形瓶中加入2.0 g全缘叶绿绒蒿粗粉，量取10 mL浓氨水碱化处理，搅拌使其混合均匀。分别加入20、40、60、80 mL的无水乙醇，浸泡5 h后，用旋转蒸发仪浓缩乙醇溶液。最后将浓缩液进行水浴蒸干，用0.1 mol/ L的盐酸溶液溶解后，按1.4.2.3中的方法测定含量。

1.4.2.5 正交试验法优化试验 正交试验设计及相应数据见表3。

表3 正交试验法设计

2 结果与分析

2.1 总黄酮试验结果分析

2.1.1 单因素试验结果分析 由图1可知，乙醇体积分数在40%时全缘叶绿绒蒿总黄酮含量最低，随着乙醇体积分数的升高总黄酮含量快速上升，乙醇体积分数在60%总黄酮含量最高，达0.113 mg/g。之后，随着乙醇体积分数的升高总黄酮含量逐渐下降，因此，最适宜提取的乙醇体积分数为60%。提取时间为1.0 h时总黄酮含量最低，随着提取时间的延长总黄酮含量快速上升，提取时间在2.0 h时总黄酮含量最高，达0.118 mg/ g。之后，随着提取时间的延长总黄酮含量逐渐下降，因此，最适宜的提取时间为2.0 h。液料比为20∶1（mL∶g）时全缘叶绿绒蒿总黄酮含量最低，随着液料比的提高总黄酮含量快速上升，液料比为30∶1（mL∶g）时总黄酮含量最高，达0.119 mg/g。之后，随着液料比的升高总黄酮含量逐渐下降，因此，最适宜提取的液料比为30∶1（mL∶g）。

图1 乙醇体积分数、提取时间及液料比对全缘叶绿绒蒿总黄酮含量的影响

2.1.2 响应面方法与预试验结果分析 利用Design-Expert 8.0.6软件分析试验结果，以总黄酮提取量为响应值，对试验数据进行二次多项式回归拟合后，得到回归方程：

式中，Y为总黄酮提取量，A为乙醇体积分数，B为液料比、C为提取时间。拟合结果表明，最适乙醇体积分数为61%，液料比为25∶1（mL∶g），提取时间为1.56 h，提取量为0.123 mg/g。模型F值为4.820，失拟项F为1.880，P（0.365 4）>0.05（表4），差异未达到显著水平，表明模型与试验数据匹配，实际试验结果较客观。影响全缘叶绿绒蒿总黄酮提取含量顺序：乙醇体积分数（34.180，0.002 1）＞提取时间（7.490，0.040 9） ＞液料比（4.210，0.095 3）。综合试验设计与二次多项式回归拟合结果，最适宜的全缘叶绿绒蒿中总黄酮的提取条件：乙醇体积分数60%、液料比25∶1（mL∶g）、提取时间1.5 h。此时，黄酮提取量最高，为0.123 mg/g。

表4 全缘叶绿绒蒿总黄酮含量回归方程方差分析

2.2 总生物碱试验结果分析

由图2可知，随着超声功率的提高，全缘叶绿绒蒿总生物碱含量呈升高又下降的趋势，超声功率为120 W时总生物碱含量最高，达1.342 mg/g。因此，最适宜的总生物碱提取功率为120 W。提取温度对全缘叶绿绒蒿总生物碱提取影响较大，40 ℃时提取量较低，60 ℃时提取量最高，达1.145 mg/g。当提取温度继续提高时，总生物碱含量反而有所降低。因此，最适宜的总生物碱提取温度为60 ℃。当液料比由10∶1（mL∶g）增加到30∶1（mL∶g）时，全缘叶绿绒蒿总生物碱含量提升较大，达1.126 mg/g。继续增加液料比时，总生物碱反而有所下降。因此，最适宜的总生物碱提取的液料比为30∶1。

图2 提取功率、提取温度、液料比对全缘叶绿绒蒿总生物碱含量的影响

由图2、表5可知，在功率为120 W、温度为40 ℃、料液比为30∶1时有最佳提取工艺。

表5 正交试验法试验结果

3 结论

本试验采用回流提取方法提取全缘叶绿绒蒿总生物碱，影响最大的因素为超声功率，其次为反应温度，最后为液料比。在功率为120 W、温度为40 ℃、液料比为30∶1（mL∶g）时产生最佳提取工艺，此时，总生物碱提取量为0.81 mg/g。最适宜的全缘叶绿绒蒿中总黄酮的提取条件：提取温度乙醇体积分数60%、液料比25∶1（mL∶g）、提取时间1.5 h，此时总黄酮提取量为0.123 mg/g。