蒜氨酸抗体的制备与应用

李明强，韩志俊，裴天容，代露露，宋姗姗，周艳萌

(1. 遵义医科大学 微生物学与免疫学实验室，遵义 563000；2. 遵义医科大学第一附属医院 急诊科，遵义 563000)

抗体是免疫系统的重要组成部分，除已知的重要功能，还可缩短抗原性药物在体内存留时间，影响药物疗效的发挥[1]。在体外可根据抗体与抗原反应的特异性和敏感性，应用免疫学技术检测、鉴定抗原物质以及深入研究抗原性药物[2-3]。蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜)为大蒜氨基酸成分，大蒜素前体物质，在蒜酶、代谢酶的作用下，蒜氨酸均可被其分解生成脂溶性有机含硫化合物，即大蒜素[4-6]，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、防治心血管疾病等多种生物活性。蒜氨酸的检测方法有利用蒜氨酸的化学性质测定其含量，但特异度、准确度差。利用蒜氨酸物理特性建立的色谱法[7-8]，结果相对可靠、准确，但需要繁琐的样本处理过程和高昂的硬件条件支持，成本较高。将免疫学技术应用于蒜氨酸检测，其敏感度、特异度、可靠性都将得到极大提高，且方法简便易行。要将免疫学技术应用于蒜氨酸的检测与研究，蒜氨酸抗体的制备是关键。本研究将蒜氨酸与蛋白质结合形成完全抗原，结合弗氏佐剂免疫家兔制备蒜氨酸抗体并作初步研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物及试剂参照文献[9]自紫皮大蒜提取蒜氨酸，将其配制成100 mg/mL溶液，备用。成年家兔20只，体质量1.5～2.0 kg，成年豚鼠1只，体质量250～300 g，两者雌雄不拘，均为清洁级，购自遵义医科大学实验动物中心。卵清蛋白，购自华中海威(北京)基因科技有限公司。山羊抗兔IgG-FITC荧光抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。山羊抗兔IgG-Cy3荧光抗体，购自武汉赛维尔生物科技有限公司。FITC，购自苏州亚科科技股份有限公司。金黄色葡萄球菌菌种CMCC26003、大肠埃希菌菌种CMCC44102，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制备 偶联抗原的制备：参照文献[10-11]，制备浓度为40 mg/mL的卵清蛋白溶液20 mL，加入蒜氨酸溶液2 mL，搅拌5 min至出现乳白色沉淀。

固定抗原的制备：将偶联抗原加入甲醛溶液，室温静置30 min，离心后收集沉淀，PBS漂洗3次，最后用等量PBS稀释。

1.2.2 动物的分组与免疫 将20只家兔随机分为2组，每组10只。家兔按表1程序免疫，联合弗氏完全佐剂，每次免疫后间隔7 d进行下一次免疫，共免疫4次。末次免疫7 d后采血，分离血清，检测抗蒜氨酸抗体。皮内和皮下注射采用1次剂量多点连续注射；静脉注射采用脱敏注射方法进行，1次免疫剂量分3次注射，8 h内完成1次免疫。

表1 家兔免疫注射程序

1.2.3 蒜氨酸抗体的检测 离心抗凝血分离红细胞，PBS漂洗3次。参照文献[12]用蒜氨酸包被红细胞，最后用PBS将红细胞配制成2%致敏红细胞悬液。

参照文献[12]用红细胞悬液进行玻片间接血凝试验和试管间接血凝试验，检测蒜氨酸抗体及其效价。

1.2.4 蒜氨酸抗体的鉴定 离心抗凝血分离淋巴细胞，参照文献[12]用蒜氨酸包被淋巴细胞，PBS冲散沉淀细胞，制备蒜氨酸抗原片备用。滴加待检免疫兔血清于抗原片，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗。滴加山羊抗兔IgG-FITC荧光抗体，37 ℃孵育1 h，漂洗；晾干，荧光显微镜下观察结果。

1.2.5 蒜氨酸抗体的应用

1.2.5.1 蒜氨酸的组织分布特点 健康豚鼠1只，于心腔内注射蒜氨酸溶液1 mL；10 min后处死豚鼠，分离心、肝、脾、肺和肾，制备石蜡切片。切片经EDTA抗原修复，淬灭自发荧光，滴加用PBS按1∶10稀释的蒜氨酸抗血清于样本上，4 ℃湿盒孵育过夜；滴加山羊抗兔IgG-Cy3荧光抗体进行50 min间接荧光染色，后用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。

1.2.5.2 蒜氨酸抗菌作用及机制的探讨 取蒜氨酸免疫兔血清50 mL，参照文献[12-14]分离纯化蒜氨酸抗体，用FITC标记抗蒜氨酸IgG抗体，制备蒜氨酸荧光抗体。

96孔板的第1孔加入蒜氨酸溶液100 μL，从第2孔开始对蒜氨酸倍比稀释至第10孔，稀释2排，第11孔蒜氨酸，第12孔为空白对照。参照文献[15]检测蒜氨酸对大肠埃希菌和葡萄球菌的杀菌作用，将细菌培养板经37 ℃培养24 h，取第1～10孔培养液，划线接种于平板培养基，观察细菌生长情况。培养72 h后检测光密度[D(450 nm)]值。收集第1至10孔培养液，单独收集第11孔培养液作为阴性对照，175×g离心5 min。取上清液加入多聚甲醛，固定上清液中细菌10 min。离心细菌沉淀，PBS漂洗3次，制备细菌涂片，干燥，丙酮固定。滴加FITC标记的家兔抗蒜氨酸抗体于细菌涂片表面，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，晾干，荧光显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 蒜氨酸抗体的检测玻片间接血凝试验显示，第1组免疫家兔样本中均可见明显红细胞凝集，第2组均未见红细胞凝集；试管间接血凝试验显示，第1组8只家兔血清抗体效价为1∶64，2只效价为1：32；第2组无效价结果。详见表2。

表2 红细胞凝集试验结果

2.2 蒜氨酸抗体的鉴定第1组可见淋巴细胞表面呈绿色荧光，第2组未见荧光染色细胞。详见图1。

注：A. 淋巴细胞表面蒜氨酸荧光染色情况(×100)；B. 心肌组织中蒜氨酸荧光染色分布情况(×40)；C. 肝脏组织中蒜氨酸荧光染色分布情况(×40)；D. 脾脏组织中蒜氨酸荧光染色分布情况(×40)；E. 肺组织中蒜氨酸荧光染色分布情况(×40)；F. 肾脏组织中蒜氨酸荧光染色分布情况(×40)。图1 荧光染色示踪蒜氨酸在组织细胞中分布情况

2.3 蒜氨酸抗体的应用

2.3.1 组织切片的免疫荧光结果观察 DAPI染出的细胞核发射蓝光，山羊抗兔IgG-Cy3抗体发射红光，表示有蒜氨酸抗体结合于该处细胞膜，具体如下。

心肌细胞：蓝色心肌细胞核、细胞膜上明显可见少量散在红色点状物。肝细胞：蓝色细胞核周围有丰富的红色荧光染色细胞膜，出现红蓝相间发光现象。脾脏细胞：明显可见较多的细胞膜表面呈现红色光斑。肺泡细胞：蓝色细胞核外有较多的红色光斑，可见肺泡组织结构特点。肾细胞：红色细胞膜包绕着蓝色细胞核，排列形成扁圆形的肾小管状，部分细胞红光强度超过蓝光。详见图1。

2.3.2 蒜氨酸的体外抗菌实验 为检测蒜氨酸的体外抑菌作用，24 h后培养板第1～10孔划线平板均有细菌生长，说明蒜氨酸无杀菌作用。72 h时第1～10孔D(450 nm)值均显著低于阳性对照孔。详见表3。收集培养液并制片，经抗蒜氨酸-FITC抗体染色，可见呈绿色荧光的菌体，对照孔细菌无绿色荧光。革兰阴性菌菌体表面荧光强度也弱于革兰阳性菌。详见图2。

表3 蒜氨酸抑菌试验结果

注：A. 大肠埃希菌菌体荧光染色情况；B. 葡萄球菌菌体荧光染色情况。图2 荧光染色示踪标记蒜氨酸于不同菌体表面分布情况(×100)

3 讨论

蒜氨酸与卵清蛋白结合，为可逆性结合，当溶液中游离蒜氨酸浓度降低，结合的蒜氨酸就会游离，成为游离蒜氨酸，沉淀溶解。有研究表明，游离蒜氨酸不具免疫原性，与动物机体自身成分结合只是一种体内运输形式[16]；蒜氨酸与动物异种蛋白可逆性结合，能否使蒜氨酸显示免疫原性，有待研究证实。甲醛固定结合物，蛋白质分子结构发生了不可逆转的改变，蒜氨酸被固定于蛋白分子，其免疫原性能否有效显现则未见研究报道。文章即采用这两种类型抗原免疫家兔，探讨其免疫原性。结果表明，蒜氨酸偶联抗原具有免疫原性，而蒜氨酸固定抗原不具免疫原性。

蒜氨酸与蛋白结合会出现沉淀，影响免疫沉淀试验检测结果，因此本研究采用间接血凝试验检测蒜氨酸抗体及其效价。蒜氨酸与蛋白质结合发生沉淀，并非蛋白质分子聚集形成的沉淀[17-18]，而是分子空间结构改变引起的沉淀。肉眼与显微镜下均未见异常的红细胞凝集现象，提示试验结果具有抗原抗体反应的高度特异性。

本研究中，于豚鼠心腔注射蒜氨酸溶液，参照文献[6]，10 min后处死豚鼠。这一处理既给予蒜氨酸在体内分布至全身组织的充分时间，又不让蒜氨酸在体内过多分解。而样本及时用甲醛固定则防止蒜氨酸游离，能真实反映蒜氨酸在体内的分布特点。在肝脏中，肝细胞表面激发了较多、较强的红色荧光，表明肝细胞具有富集蒜氨酸的能力，以供代谢需要；肾脏组织切片荧光染色显示蒜氨酸能通过肾小球滤过作用，经肾小管被大量重吸收，与文献报道[6]相符；肺泡组织中，细胞表面显示丰富的红色光斑，是含蒜氨酸血液在肺部进行气体交换所致；脾脏为特殊的免疫器官，有大量的血液成分分布，表明蒜氨酸在血液细胞的分布显著高于一般组织细胞；心脏虽然血流丰富，但血液限于血管及心腔内，因此心肌细胞的蒜氨酸分布可代表蒜氨酸在一般组织细胞的分布特点。

微量稀释法结果显示蒜氨酸有较好的抑菌作用，无杀菌作用。蒜氨酸与蛋白质结合影响结果观察，培养72 h后抑菌孔D值显著低于阴性对照孔，说明细菌在进行缓慢代谢，分解蒜氨酸，同时沉淀逐渐减少。免疫荧光染色检测菌体表面蒜氨酸结合情况，结果显示2种细菌抑菌孔中的菌体均有较好的激发荧光，提示抑菌孔中的菌体表面结合有大量蒜氨酸，导致菌体蛋白空间结构改变，阻断细菌细胞壁、细胞膜与环境间的物质交换；同时，蒜氨酸也与细菌酶蛋白结合，抑制酶活性，从而抑制其生命活动，发挥较强的抑菌作用。当细菌离开高浓度蒜氨酸环境后，结合蒜氨酸从菌体和酶蛋白上游离，细菌细胞壁与细胞膜正常生理活动恢复，酶蛋白活性恢复，细菌恢复正常生长繁殖。革兰阴性杆菌细胞壁薄，革兰阳性球菌细胞壁厚而致密，镜下也可见革兰阴性菌表面荧光强度较阳性菌弱，可能导致蒜氨酸对革兰阳性菌和革兰阴性菌最低抑菌浓度具有显著差异，有待进一步研究证实。

综上所述，蒜氨酸为半抗原物质，正确选择好载体、偶联方法，能够提高其免疫原性。通过合理的免疫程序免疫动物，即可获得高效的蒜氨酸抗体，可应用于体内外蒜氨酸的基础与临床研究。