桂花及其近缘种倍性和基因组大小分析

段一凡，李 岚，杨欣欣，王贤荣，张 敏，张 成，柴子涵

(1.南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037；2.国际木犀属植物栽培品种登录中心，南京林业大学，江苏 南京 210037)

桂花(Osmanthusfragrans)属木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)，在我国已有2 500多年的栽培历史，为我国十大传统名花之一。木犀属全世界约35种，中国有24种，是该属植物的现代分布中心[1-2]。本犀属植物的花多具芳香性，观赏价值极高。目前桂花及其近缘种齿叶木犀(O.×fortunei)、柊树(O.heterophyllus)、华东木犀(O.cooperi)在分类处理上仍存在较多争议：其中四季桂先后被作为变种、类、组或一个品种而记载，陆瑞林[3]和季春峰[4]指出四季桂的特征，与Loureiro[5]在原始描述中的特征一致，因此支持四季桂是桂花的原变种的处理；胡绍庆等[6]则认为四季桂是新变种，定名为Osmanthusfragransvar.subpaniculatusS. Q. Hu。郭世权[7]在木犀属分子系统学研究中，将华东木犀和桂花的几个品种归聚为一类，并且得到很高的支持，说明华东木犀的分类学位置还有待探究。齿叶木犀被认为是桂花和柊树的杂交种[3]，由于缺乏证据支持，《Flora of China》没有处理，它们之间的关系还不清楚[8]。对于上述问题，前人多从形态学和微解剖学方面提供证据[9-12]，但在染色体倍性及基因组大小方面还鲜有报道[13-14]。

流式细胞术(flow cytometry，FCM)在植物学研究中主要用于检测植物倍性水平及基因组大小[15]。基因组大小亦称C值，指一个染色体组DNA含量[16]。近缘物种的C值相似程度很高，基因组大小的获取对于构建物种系统进化树、鉴定杂交种、分析种间亲缘关系有着重要的意义[17]。

本研究以水稻品种‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)为参照样品，用流式细胞术对桂花代表品种及其近缘种的倍性和基因组大小进行测定分析，旨在从细胞学领域为桂花分类提供证据，为今后开展木犀属植物的基因组测序、物种分类以及种群进化研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

所用材料及采集地点见表1，其中凭证标本存放于南京林业大学标本馆(馆代码：NF)。以相关材料刚萌发的新生嫩叶为实验材料。参照样品为水稻品种‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)，由江苏省农业科学院提供。

表1 材料来源Table 1 Source of plant material used in the study

1.2 实验方法

1.2.1 细胞核悬浮液的制备

采集刚萌发的新生嫩叶，装入自封袋放置冰盒保存。用蒸馏水清洗2～3次，再用滤纸吸干叶片上的水分。滴入0.5 mL预冷的裂解液于塑料培养皿中，之后剪取叶片(去除中脉和叶缘锯齿)约1 g，分别放入培养皿中，再加入预冷的裂解液0.5 mL，然后用锋利的刀片垂直快速地将叶片切碎，使其与裂解液充分接触。使用1 mL移液枪吸取塑料培养皿内的溶液，用孔径37 μm(400目)尼龙网过滤，将获得的滤液装入1.5 mL离心管中，用锡纸避光处理，再在4 ℃下转速1 000 r/min离心15 min。弃上清后，加入500 μL预冷的PI(碘化丙啶)和RNA酶进行染色，参照田新民等[18]配方，然后置于4 ℃ 冰箱避光染色10 min左右。

1.2.2 细胞裂解液的选择

流式细胞术中，细胞裂解液的作用是使细胞中游离出完整的细胞核，其选择至关重要，合适的裂解液能使样品的分析更加准确可靠。参照前人经验选择Chopping、Galbraith’s、Tris·MgCl2、LB01、GPB和WPB 6种裂解液分别对桂花及其近缘种进行检测[18-20]。

1.2.3 流式细胞仪检测

采用BD Influx 流式细胞仪对制备的样品细胞核悬浮液进行测定，通过488 nm蓝光激发，每个样品重复3次并且每次检测至少收集10 000个细胞。变异系数CV值控制在5%之内，测定所得的图像由流式细胞仪自带的软件(BD FACS sortware 1.0.0.650 软件)进行数据处理。通过下列公式计算基因组大小(C值)：

待测样本基因组大小=参照样本基因组大小×(待测样本G0或G1峰荧光均值/参照样本G0或G1峰荧光均值)

标准物的选取包括内标和外标。本研究采用外标法，以已知二倍体的柊树(2n=46)[13]作为参照样本，先上机对其进行检测，随后调整流式细胞仪阈值，依次检测14个桂花品种及其近缘种(表1)的倍性。选用已知基因组大小的水稻品种‘日本晴’(420 Mb)[21]为内标，分别对水稻与待测样本的混合样品进行上机检测，比较水稻与待测样本DNA峰值的荧光均值比值关系，计算桂花品种及其近缘种的基因组大小。

2 结果与分析

2.1 桂花及其近缘种倍性分析

根据流式细胞仪测定图像，已知二倍体的柊树和其他被检测的样本主峰都位于相对荧光强度值=10附近，故分析待测样本在误差范围内均为二倍体。这与Taylor[13]1945年发表的结果一致。部分样品检测结果见图1，其中横坐标为DNA相对荧光强度，纵坐标为细胞数量。

图1 部分样本的流式检测结果Fig.1 The results of partial samples using flow cytometry

2.2 桂花及其近缘种基因组大小测定

各桂花品种及其近缘种与水稻混合样品上机检测的部分结果见图2，参照水稻的峰值，计算14个桂花品种及其3个近缘种基因组大小，结果见表2，所选桂花品种及其近缘种基因组大小存在一定差异。桂花的基因组大小的平均值为755.24 Mb。华东木犀的基因组最大，为817.19 Mb，其次为柊树(769.50 Mb)和齿叶木犀(729.11 Mb)。齿叶木犀和桂花、柊树都为700 Mb左右，支持齿叶木犀为桂花和柊树的杂交种的观点。华东木犀的基因组大小(817.19 Mb)与桂花品种‘雄黄’(801.15 Mb)、‘金球’(808.57 Mb)和‘云田彩’(832.79 Mb)比较接近，初步表明它们之间具有较为亲密的关系。桂花品种群中四季桂品种群的基因组大小为777.24 Mb，金桂品种群为760.85 Mb，银桂品种群为739.06 Mb，丹桂品种群为717.29 Mb，彩叶桂品种群为781.76 Mb，其中‘四季’最大，达到903.14 Mb，和其他样品的差异较大，是否可以推断四季桂品种群具有更独立的分类位置还需进一步研究的支持。

P3.水稻‘日本晴’(Oryza sativa ‘Nipponbare’);P4.样品材料sample。图2 混合样本的流式检测结果Fig.2 The results of mixed samples using flow cytometry

表2 木犀属待测样品与水稻样品的流式细胞仪结果Table 2 Test results of Osmanthus and Oryza sativa species using flow cytometry

2.3 木犀科植物的C值

在该研究中，木犀属(Osmanthus)C值平均值为0.77 pg。在植物C值数据库中对木犀科进行检索，共16条数据，主要有梣属(Fraxinus)、丁香属(Syringa)、夜花属(Nyctanthes)、素馨属(Jasminum)、女贞属(Ligustrum)和木犀榄属(Olea)[22]。统计分析表明，C值平均值小于1的为木犀属(0.77 pg)和梣属(0.93 pg)，大于1的为夜花属(1.23 pg)、丁香属(1.25 pg)、素馨属(1.44 pg)、女贞属(1.57 pg)和木犀榄属(1.95 pg)，这7个属呈递增的趋势，其中木犀属的平均值最小，显著低于其他属。Leitch等[23]研究表明，陆生植物基因组大小的进化趋势是增大，越古老的植物基因组越小。木犀科植物基因组大小是否也遵循这一规律还需进一步研究。此次研究中17个木犀属植物的C值为首次测定结果，在增加植物C值数据库中数据的同时，对了解木犀属植物C值特征具有重要的意义。

3 讨 论

此次实验选择的6种不同裂解液提取的悬浮液经上机检测后，WPB和LB01的效果较好，碎片峰与样本峰可以明显地区分开来，CV值低于7%，说明细胞核完整性较好，变异系数低，保证了实验数据的可靠性。

植物内标可以将荧光抑制因子的效果最小化，减小实验过程中产生的技术误差。因此，一般采用植物内标来测定植物的基因组大小。标准植物的选择应该具备以下3个条件：①标准植物的基因组大小已知且稳定，和待测样品的染色体结构相似；②标准样品峰不能同待测样品峰重叠；③标准植物要易于培养，能获取大量样品。

选择合适的内标植物是保证流式细胞术准确分析基因组大小的前提。该实验在前期曾尝试培养番茄作为内标，但在其与待测样品混合上机检测后，二者的细胞核不易分开，吸收峰重叠较多，说明番茄不适合作为内标植物测定桂花及其近缘种的基因组大小。最后，确定水稻品种‘日本晴’为内标，待测样品与水稻基因组大小的测定峰并无重叠且区分度良好，充分保证了用已知基因组大小的水稻品种‘日本晴’作为内标来测定基因组大小结果的准确性。

此次实验测定结果表明，所选桂花品种及其近缘种都是二倍体，没有出现多倍化的现象。之前有研究表明：樱花(Cerasussp.)[24]、桑树(Morussp.)[25]及菊花(Chrysanthemunsp.)[26]等在长期自然选择和人工选择的作用下形成了丰富的类型，多倍体普遍存在，这可能是因为它们自然杂交比较容易。另外粮食作物，如小麦(Triticumaeestivum)和水稻(Oryzasativa)[27-28]也都有多倍化现象，此次实验所选的桂花及其近缘种没有多倍化，可能是因为所选桂花品种和近缘种少，还需进一步研究。

前人研究表明：在某些特定的条件下，基因组大小的差异可能与基因的重复或丢失有关，另外，纬度、海拔以及气候之间的差异也都可能造成DNA含量的变异。这种种内DNA含量的变化在其他被子植物中也存在，如Bennett[29]检测了24种被子植物基因组大小，提出植物种内DNA含量的变化是普遍存在的。吴丽萍等[30]以毛果杨(Populustrichocarpa)为内标，测定6种枣属(Ziziphus)植物基因组大小，结果发现各枣品种的基因组大小存在差异。

实验结果表明，桂花14个代表品种及其近缘种都是二倍体，但基因组大小各不相同，其中‘四季’的基因组大小最大，为903.14 Mb，达到了属内物种间的水平；实验结果初步表明华东木犀与桂花品种间具有较为紧密的关系；支持齿叶木犀为桂花和柊树的杂交种的观点。这些结果为桂花及其近缘种分类上的问题提供了一定证据，进而为木犀属物种分类、基因组学研究、基因组文库的建立及全基因组测序提供了基础数据。

致谢南京林业大学现代分析测试中心林峰老师在实验过程中给予帮助与支持；江苏省农业科学院及常州市芳芝林现代农业产业园区提供实验材料。