黄芩UPLC-DAD指纹图谱的建立及其黄芩苷和汉黄芩苷的含量研究

郑如文，刘港辉，江志强，董玉君，张俊华，程国华*（.广州白云山光华制药股份有限公司，广州508；.暨南大学药学院，广州 5063）

黄芩是唇形科黄芩属多年生草本植物，干燥根为药用部位，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效[1]，可用于肺热咳嗽、胎动不安等症。黄芩中活性成分以黄酮类化合物为主，包括野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素 A 等，其中黄芩苷是评价黄芩药材质量的主要依据[2-3]。《中国药典》2020年版一部中收载了HPLC 法测定黄芩苷成分的含量标准[4]，但未见其他黄酮类成分及指纹图谱的检测标准。中药指纹图谱作为鉴定和评价中药质量的重要技术，已经成为国内外中药材和天然药物质量控制的常用方法[5-7]。

超高效液相色谱技术（UPLC）能够快速地分析和鉴定药材中的化学成分，具有高分辨率的特点[8-9]。本研究采用UPLC 和优化的超声提取方法[10-12]，同时测定黄芩苷和汉黄芩苷成分的含量并建立相应的指纹图谱，为黄芩药材的质量评价方法提供参考。

1 材料

1.1 仪器与试药

UPLC-DAD（Agilent Infinity 1290Ⅱ）；KQ-500VDB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XPE26 型百万分之一天平、ML204T型万分之一天平（美国梅特勒公司）；BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters）；黄芩苷（批号：110715-201821，纯度：95.4%）、汉黄芩苷（批号：112002-201702，纯度：98.5%）、野黄芩苷（批号：110842-201709，供含量测定用）、黄芩素（批号：111595-201808，供含量测定用）、汉黄芩素（批号：111514-201706，供含量测定用）对照品（中国食品药品检定研究院），千层纸素A对照品（批号：Y31M9H62597，供含量测定用，源叶生物）；甲酸（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）。

1.2 样品

共采集5 个产地不同生长年限的26 批黄芩干燥根，经暨南大学药学院中药教研室张英副教授鉴定均为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）。来源见表1。

表1 不同产地黄芩干燥根的来源Tab 1 Sources of dried roots of Scutellaria baicalensis Georgi from different origins

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱14 min（见表2），后运行5 min；检测波长280 nm；流速0.4 mL·min－1；柱温40 ℃；进样量2 µL。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution

2.2 指纹图谱共有峰的确定

将样品的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，系统生成黄芩药材的对照指纹图谱（见图1）。通过对照品明确黄芩药材的6 个特征峰（见图2），分别为野黄芩苷（1）、黄芩苷（2）、汉黄芩苷（3）、黄芩素（4）、汉黄芩素（5）和千层纸素A（6），保留时间分别约为2.5、5.3、8.5、10.5、12.2、12.4 min，选黄芩苷（B）作为参照峰（S），计算6 个特征峰的相对保留时间、相对峰面积。

图1 黄芩样品的UPLC 对照指纹图谱Fig 1 UPLC spectra of Scutellaria baicalensis samples

图2 黄芩样品与黄芩对照品的指纹图谱Fig 2 Fingerprints of Scutellaria baicalensis sample and standards

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷29 mg、汉黄芩苷6 mg 于同一50 mL 量瓶中（均经折算），加甲醇定容，摇匀。配成黄芩苷质量浓度为0.58 mg·mL－1、汉黄芩苷质量浓度为0.12 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 称取黄芩粉末（过65目筛）约0.3 g，精密称定，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密移取50 mL 70%甲醇于锥形瓶中，称重，超声50 min，冷却至室温后补足失重，摇匀过滤，取1 mL 续滤液，置于10 mL 量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液，待测。

2.4 含量测定方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密移取混合对照品溶液适量制得黄芩苷质量浓度分别为0.5473、0.2736、0.1368、0.0684、0.0342、0.0171、0.0086 mg·mL－1和汉黄芩苷质量浓度分别为 0.1108、0.0554、0.0277、0.0139、0.0069、0.0035、0.0017 mg·mL－1的系列混合对照品溶液。吸取各混合对照品溶液2 μL 注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行分析。以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得到回归方程见表3。

表3 黄芩苷与汉黄芩苷回归方程Tab 3 Regression equation of baicalin and wogonin

2.4.2 重复性试验 精密称取同一份黄芩药材粉末6 份，按“2.3.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积，计算黄芩苷、汉黄芩苷平均含量的RSD值分别为1.4%和1.3%，表明方法重复性好。

2.4.3 精密度试验 精密吸取同一份黄芩供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，每次进样量2 μL。记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积积分值，结果两者含量的RSD分别为0.25%和0.36%，表明分析方法精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一黄芩供试品溶液（n＝6），按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样，记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积，结果两者含量的RSD值分别为0.42%和1.3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.5 加样回收试验 取已知含量的黄芩药材0.1 g，各平行操作6 份，分别精密加入黄芩苷对照品（约13 mg）和汉黄芩苷对照品（约3 mg），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行检测，结果黄芩苷、汉黄芩苷的平均回收率为98.0%和99.2%，RSD＜5%，表明方法回收率良好。

2.5 指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度试验 以黄芩苷（B）为参照峰（S），计算其余5个共有峰的相对保留时间与相对峰面积，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行评价，结果显示各共有峰的相对保留时间RSD在0.12%～0.19%，相对峰面积的RSD在0.11%～0.54%，表明仪器精密度良好（见图3）。

图3 精密度指纹图谱Fig 3 Fingerprint of precision

2.5.2 重复性试验 以黄芩苷（B）为参照峰（S），计算其余5 个共有峰的相对保留时间与相对峰面积，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”进行评价，结果显示各共有峰的相对保留时间RSD在 0.10%～0.15%，相对峰面积的RSD在 0.26%～3.8%，表明方法重复性良好（见图4）。

图4 重复性指纹图谱Fig 4 Fingerprint of repetitive

2.5.3 稳定性试验 以黄芩苷（B）为参照峰（S），计算其余5 个共有峰的相对保留时间与相对峰面积，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”进行评价，结果显示各共有峰的相对保留时间RSD在 0.10%～0.23%，相对峰面积的RSD在 0.38%～1.3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定（见图5）。

图5 稳定性指纹图谱Fig 5 Fingerprint of stability

3 结果

3.1 样品含量测定

取26 批次黄芩样品粉末（过65 目筛）各约0.3 g，每个样品平行称取2 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行分析，测量黄芩苷和汉黄芩苷的峰面积，计算样品中黄芩苷和汉黄芩苷的百分含量，结果见表4。

表4 26 批黄芩样品中黄芩苷与汉黄芩苷的含量Tab 4 Contents of baicalin and wogonin in 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

3.2 指纹图谱建立

分别称取26 批黄芩粉末按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，注入超高液相色谱仪，得到样品图谱，将26 批样品的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，得到叠加指纹图谱（见图6），选择黄芩苷（B）作为参照峰，计算6 个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果相对保留时间的RSD均小于0.70%（见表5和表6），表明各批次之间的相对保留时间重现性和分离度好，特征峰明显。

表5 26 批黄芩样品的共有峰相对保留时间Tab 5 Relative retention time of common peaks of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

表6 26 批黄芩样品的共有峰相对峰面积Fig 6 UPLC overlay fingerprints of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

图6 26 批黄芩样品的UPLC 叠加指纹图谱Fig 6 UPLC overlay fingerprints of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

3.3 相似度分析

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”中位数法计算26 批黄芩药材相似度，结果显示S1～S26 的相似度均大于0.99，表明不同产地、不同季节及不同生长年限的黄芩药材之间质量稳定，一致性好，无异常样品。

3.4 聚类分析

以26 批样品的6 个共有峰相对于黄芩苷（B）的相对峰面积为变量，使用SPSS 22.0 软件，采用组间连接和平方Euclidean 距离法进行系统聚类分析。结果显示，当欧式距离为10 时，26 批样品共分为5 类，相似度和聚类分析的结果基本一致，且与样品的地域性关系不明显（见图7）。

图7 26 批黄芩样品聚类分析图Fig 7 Cluster analysis chart of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

4 讨论

4.1 提取条件的优化

以黄芩苷得率为主要考察指标，考察不同溶剂（体积分数50%～70%甲醇，间隔10%）、不同目筛（50、65、80 目）和不同超声时间（50、60、70 min）对提取效率的影响，结果表明，在70%甲醇，过65 目筛，超声50 min 时，黄芩苷得率最高，可达17.34%，而按《中国药典》2020年版的回流提取方法黄芩苷得率仅约12%。

4.2 黄芩苷与汉黄芩苷的含量分析

采集不同产地的26 批样品中，除河北地区野生的3 个批次（S24、S25、S26）外，黄芩苷的百分含量均在9%以上，符合《中国药典》2020年版要求。26 批黄芩药材的黄芩苷和汉黄芩苷平均含量分别为12.75%、2.66%。山西产黄芩苷和汉黄芩苷含量最高的为春季三年生黄芩，陕西产黄芩苷和汉黄芩苷含量最高的为春季二年生黄芩，山东产黄芩苷和汉黄芩苷含量最高的为秋季二年生黄芩，甘肃产黄芩苷和汉黄芩苷含量最高的为秋季二年生黄芩，河北产黄芩苷和汉黄芩苷含量最高的为承德头沟镇春约一年生黄芩。5 个产地综合比较，山东秋季二年生黄芩的黄芩苷含量最高，甘肃秋季二年生黄芩的汉黄芩苷含量最高。河北承德高台寺镇春野生2 中黄芩苷和汉黄芩苷含量均最低，河北野生黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷的含量明显比栽培黄芩低，这可能与其枯心和粗皮性状以及表面泥土较多有关。

不同生长年限中的黄芩苷和汉黄芩苷含量差异较大，但可以发现黄芩苷和汉黄芩苷含量总体呈二年生＞一年生＞三年生＞野生的规律，二年生含量达到最高值。不同产地的黄芩苷平均含量：陕西＞山东＞甘肃＞山西＞河北，其中陕西、山东和甘肃产地的黄芩苷平均含量较一致，均在14%左右，河北产地黄芩苷含量最低，约9%；不同产地的汉黄芩苷平均含量：山东＞甘肃＞陕西＞山西＞河北，除河北地区较低外（约2%），其余4 个主产地的汉黄芩苷含量均在3%左右。

4.3 小结

本试验在超高效液相色谱仪的基础上，结合超声优化提取方法，采用0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）的流动相，梯度洗脱14 min，测定黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的含量，并建立6 种黄酮类成分的指纹图谱。各批次之间的相对保留时间重现性和分离度好，准确可靠，可为完善黄芩的质量控制与评价提供参考。