牛肉中头孢喹肟残留的HPLC检测方法的研究
2021-10-09阿力腾才斯克
阿力腾才斯克，卢 琳
（新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐830063）
头孢喹肟是一种动物专用第四代头孢类抗生素，抗菌谱广、抗菌活性强并对β内酰胺酶高度稳定而被广泛用于猪、牛呼吸道细菌性感染、急性乳房炎疾病的临床治疗，以提高药物疗效。畜禽养殖业是应用抗生素的主要领域之一，降低畜禽的发病率与死亡率，促进生长和提高健康养殖方面发挥着主要作用，但使用不当危害很大。畜禽粪便通过施肥方式进入土壤环境中，导致兽用抗生素从畜禽体到土壤和水环境转移，对环境微生物形成持续性的诱导和筛选压力从而导致兽用抗生素性基因的污染风险，对人类造成直接或间接的伤害，是人们面临的巨大威胁。因此我国农业农村部对兽用抗生素头孢喹肟在动物源性食品中的最高残留量（MRL）做出了严格规定。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Waters公司,紫外检测器），高速冷冻离心机（德国sigma公司），（插入）EYELA旋转蒸发仪，Sartorius分析天平:（感量0.00001 g），涡旋混匀器，DELTA 320 pH计（METTLER公司）。对照品硫酸头孢喹肟来源：德国Dr.Ehrenstorfer公司，含量93.9%，批号：G130285。HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），微孔过滤膜0.45 μm，移液器。试剂：高氯酸，乙腈为色谱纯；正丙醇，正己烷，甲醇[1]。
1.2 溶液配制
1.2.1 对照溶液的配制
头孢喹肟标准储备液（1 mg/mL）:精确称取硫酸头孢喹肟对照品11.85 mg置于10 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，得到1 mg/mL标准储备液。4℃保存，有效期1个月[2]。
头孢喹肟标准工作液（2 μg/mL）:精确量取1 mg/mL标准储备液0.1 mL置于50.0 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液稀释至刻度。
1.2.2 高氯酸-磷酸缓冲液
取浓磷酸3.4 mL，缓慢加适量的水稀释再加入高氯酸钠3.45 g，用三乙胺调至pH 3.6，用水定容至1 000 mL。
1.2.3 50%乙腈水溶液
取乙腈50 mL，用水稀释至刻度100 mL，混匀。
1.2.4 5%乙腈水溶液
取乙腈5 mL，用水稀释至刻度100 mL，混匀。
1.2.5 流动相
0.1%甲酸：乙腈（88：12，V/V）[3]。
1.3 实验方法
1.3.1 方法原理试样中残留的头孢喹肟经高氯酸钠缓冲液及乙腈混合提取，旋转蒸发后加水复溶，HLB固相萃取柱净化，流动相洗脱后经高效液相色谱测定，并借助外标法完成定量。
1.3.2 色谱条件色谱柱为Waters XTerr MS C18(4.6×250 mm)粒径5 μm，柱温35℃；流动相为0.1%甲酸：乙腈（88：12，V/V），流速1.0 mL/min，进样量50 μL，紫外检测器，检测波长270 nm。
1.3.3 标准曲线及线性范围
无误称量2 μg/mL标准工作液0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL分别置于10.0 mL容量瓶中。浓度为10、50、100、300、500 ng/mL的标准液。将其一次上机测定，以峰面积与对应的质量浓度做出相应的曲线见图1，展开回归分析。
1.3.4 牛肉组织样品的提取
无误量取均匀的牛肉组织试料4.0 g，并将其放进50 mL具塞离心管内，加入高氯酸-磷酸缓冲液2 mL，乙腈10 mL，涡旋混匀，震荡8 min,10 000 r/min离心5 min，取上清液于茄形瓶中，再按上述步骤重复提取一次，合并两次上清液，加正丙醇5 mL，在40℃下旋转蒸发近干。残渣中加入水10 mL溶解至，再加正己烷5 mL，涡旋混匀。转移至50 mL离心管中，4℃下10 000 r/min离心8分钟，取下层清液备用[4]。
1.3.5 净化
HLB小柱一次用甲醇2 mL和水2 mL活化，备用液全部过柱，再依次用水5 mL和5%乙腈水溶液5 mL洗涤，抽干后用流动相2.0 mL洗脱，收集于10 mL玻璃试管中，涡旋混匀后过0.45 μm微孔滤膜，共高效液相色谱测定。
1.3.6 方法准确度和精密度
分别精密量取含有头孢喹肟2 000 ng/mL标准工作液0.02 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，1 mL加入4 g空白牛肉样品中，制成头孢喹肟为10、50、100、200，500 ng/g五个浓度相异的添加样品，各浓度5个平行样，重复5批次，将回收率算出。
1.3.7 灵敏度的测定
将头孢喹肟标准工作液适量加入4 g空白牛肉组织样品中，制成头孢喹肟为10、15、25 μg/kg三个浓度相异的添加样品，处理好之后，取50 μL进样分析，从而对检测限、定量限加以清晰明确。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
在头孢喹肟浓度为10～500 ng/mL的时候，峰面积和浓度具有较佳的线性关系，相关系数R=0.999969，线性方程是Y=3.45×106+6.02×103。标准曲线见图1。
图1 标准曲线图
2.2 回收率与精密度
从表1数据可见，出头孢喹肟在空白牛肉样品力的回收率都在60%以上，批间相对标准偏差均≤20%，与有关规定相符[5]。
表1 头孢喹肟药物在牛肉中回收率和精密度的测定结果（n=5）
2.3 液相色谱图
50 ng/mL头孢喹肟标准品、试剂空白、牛肉样品空白、50 ng/g阳性添加样品的色谱图如图2、3、4、5。
图2 添加50 ng/mL标准品图谱
通过色谱图可以看出，图2中在5.309 min处为头孢喹肟的色谱峰，图3试剂空白图谱和图4牛肉样品空白谱图在允许保留时间段内均未出峰，说明所用试剂和空白样品无污染。图5牛肉空白样品添加回收色谱图中5.435 min处出现色谱峰，根据标准品出峰保留时间可以判断其为头孢喹肟的色谱峰。
图3 试剂空白图谱
图5 牛肉空白样品添加回收（50 ng/g）阳性色谱图
2.4 检测方法的灵敏度
按1.3.4和1.3.5项方法处理，当添加浓度25 μg/kg头孢喹肟，测得头孢喹肟药物的信噪比s/n/<25,说明方法的检测限可至25 μg/kg[6]。
3 讨 论
3.1 紫外检测器的选择
对头孢喹肟的标准溶液做紫外吸收分析，从吸光度数据可知，头孢喹肟的最大系数出现在270 nm波长位置[7]。
3.2 提取溶剂的挑选
在提取药物期间，将提取液拟定为有机溶剂，譬如乙腈、丙酮、甲醇等，通过数次实验探索尝试之后，最终决定将提取剂选定为乙腈、高氯酸钠缓冲液。
3.3 正己烷的运用
在提取脱脂期间，分别对异辛烷、正己烷的脱脂效果展开对比，结果法案使用其中的后者脱脂之后，溶液的杂质相对更少一些，这对目标物的检测十分有利，具有较佳的成效[8]。
3.4 提取液浓缩
在提取期间，需借助旋转蒸发来对提取液进行浓缩，在浓缩的时候要防止蒸干，一旦全部蒸干，那么样品就会被吸附于鸡心瓶内壁，从而导致回收率受到干扰，所以仅需浓缩至最小体积[9]。
4结 论
通过高效液相色谱-紫外检测法对牛肉组织中头孢喹肟药物的残留量进行测定，此方法简单易行、无误性高、回收率高，检测限亦可达成相应的要求，而且值得信赖。所以，本文所建立的头孢喹肟在牛肉组织中的残留检测方法从技术层面为以后该药的残留监控进行有力支持，这对提高牛肉食品的质量、保障消费者健康都具有重要的意义[10]。
