山茱萸不同炮制品中8个化学成分的含量测定

肖红，王东春，舒琴，周莉娟

内江市第二人民医院 药剂科，四川 内江 641000

山茱萸具有涩精固脱、补益肝肾的功效，现代药理研究表明，山茱萸具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、保护神经、抗阿尔茨海默病等作用，主产于我国陕西、甘肃、浙江、山西、江西、安徽、山东等省，为我国传统名贵中药材[1]。山萸肉是山茱萸科山茱萸属植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉[2]，具有补益肝肾、收涩固脱的功效。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版记载，山茱萸的炮制品有山萸肉和酒萸肉，《河南省中药饮片炮制规范》2005 年版记载，山茱萸炮制品有山萸肉、酒蒸山萸肉、蒸山萸肉和醋蒸山萸肉。文献资料显示，醋蒸山萸肉可增强收敛涩精作用，清蒸山萸肉、酒蒸山萸肉可增强补肝肾作用[3]。山萸肉生品活性成分主要包括环烯醚萜苷类（莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷等）、有机酸（没食子酸）及其酯类、五环三萜类（齐墩果酸、熊果酸等）、鞣质、多糖等[4]，其中，莫诺苷、马钱苷具有抗神经退行性病变、抗血栓、抑制黑色素、抗糖尿病等作用[5]；5-羟甲基糠醛具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病及抗组织缺氧等药理活性[6]；獐牙菜苷有保护肝细胞、促进细胞修复的作用；山茱萸新苷Ⅰ具有抗炎、保肝利胆、抗氧化、调节心血管系统[7]及防治骨质疏松[8]等功效；齐墩果酸与熊果酸为同分异构体，均具有降血糖、调血脂[9]、保肺、保肝、抗肿瘤[10]的作用；没食子酸具有抗氧化、抗癌、降血糖、调血脂等作用[11]。现有文献多集中在山萸肉和酒萸肉的含量测定，尚未有关于同时测定山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉中有效成分含量的文献研究[12-15]。鉴于此，本研究利用高效液相色谱法（HPLC）对山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉中熊果酸、没食子酸、齐墩果酸、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ8 个成分含量进行比较，为提高山茱萸炮制品的质量提供参考。

1 材料

U-3000 型高效液相色谱仪（UV2489PDA 检测器，美国赛默飞世尔公司）；YF-111型高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；ABS-135S型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-3200B型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

3 批山茱萸药材均购于禹州药材市场，标示产地为河南西峡，经内江市第二人民医院许琼主任中药师鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉分别按照《中国药典》2020 年版四部通则0213 炮制。对照品山茱萸新苷Ⅰ（批号：PS1022-0025）、獐牙菜苷（批号：PU0045-0025）均购于成都普思生物科技股份有限公司，纯度均大于98%；对照品没食子酸（批号：110831-201605，纯度：90.8%）、熊果酸（批号：110742-201622，纯度：94.7%）、莫诺苷（批号：111998-201602，纯度：96.3%）、5-羟甲基糠醛（批号：111626-201711，纯 度：99.4%）、齐墩果酸（批号：110709-201607，纯度：91.7%）、马钱苷（批号：111640-201707，纯度：99.2%）购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Stamsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，10%A；5～10 min，10%～27%A；10～30 min，27%～40%A；30～50 min，40%～60%A；50～65 min，60%A；65～70 min，60%～10%A）；检测波长[15]：218 nm（0～10 min，没食子酸）、284 nm（10～15 min，5-羟甲基糠醛）、240 nm（15～50 min，莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷Ⅰ）、360 nm（50～70 min，齐墩果酸和熊果酸）；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。在上述色谱条件下，供试品中各色谱峰与相邻色谱峰分离良好，色谱峰对称因子均在0.95～1.05，理论板数按莫诺苷计不低于5000。色谱图见图1。

图1 山茱萸供试品溶液和混合对照品溶液高效液相色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取8 个待测成分对照品适量，精密称定，置同一100 mL 量瓶中，用甲醇超声溶解并定容，摇匀，制成熊果酸、没食子酸、齐墩果酸、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ质量浓度分别为0.287、0.080、0.659、0.051、1.247、2.691、0.002、0.429 mg·mL-1的混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别取山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉样品各约20 g，粉碎过筛（二号筛），混匀，分别精密称取细粉1.0 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入80%甲醇30 mL，闭塞，称量，超声提取（功率：250 W，频率：40 kHz）60 min，放冷至室温，称质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过（0.45 μm），即得[16]。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取2.2.1 项下混合对照品溶液，分别量取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL 量瓶中，用甲醇定容并稀释制成系列质量浓度混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积。以对照物质量浓度为横坐标（X），8 成分色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。数据见表1。

表1 山茱萸8个成分的回归方程及线性范围

2.3.2 精密度试验 取2.2.2 项下山萸肉供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6针，记录色谱图峰面积，计算峰面积RSD。结果熊果酸、没食子酸、齐墩果酸、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ峰面积RSD 分别为1.65%、1.22%、1.37%、0.64%、1.05%、1.27%、0.86%、1.41%，均符合要求，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取2.2.2 项下山萸肉供试品溶液，分别于0、3、6、9、12 h 后，按2.1 项下色谱条件测定，记录色谱图并计算8 个成分峰面积RSD。结果熊果酸、没食子酸、齐墩果酸、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ峰面积RSD 分别为0.88%、1.06%、1.34%、1.52%、1.35%、1.74%、1.64%、1.09%。表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.3.4 重复性试验 精密取同一批山萸肉供试品粉末适量，按2.2.2 项下方法平行制备6 份，按2.1 项下色谱条件分析，记录色谱图并计算8 个化学成分的峰面积RSD 及含量。结果没食子酸、齐墩果酸、熊果酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷Ⅰ含量RSD 分别为1.32%、1.68%、1.12%、0.96%、1.37%、1.11%、1.06%、0.89%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批已知含量的山萸肉供试品，精密称取0.5 g，平行9份，分别置100 mL具塞锥形瓶中，分成低、中、高3组，分别精密加入含没食子酸0.097 mg·mL-1、齐墩果酸0.797 mg·mL-1、熊果酸0.347 mg·mL-1、5-羟甲基糠醛0.002 mg·mL-1、莫诺苷3.252 mg·mL-1、獐牙菜苷0.062 mg·mL-1、马钱苷1.507 mg·mL-1、山茱萸新苷Ⅰ0.518 mg·mL-1的混合对照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2项下方法制备，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，计算8 个化学成分的加样回收率及相应RSD，结果见表2。

表2 山茱萸8个化学成分加样回收率试验

续表2

2.4 样品含量测定

取3 批山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉供试品，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，每批依法平行测定3 次，记录色谱图峰面积，计算各成分的含量，结果见表3。

表3 山茱萸样品含量测定结果（n=3） mg·g-1

3 讨论

3.1 待测成分的选择

现代研究表明，山萸肉生品活性成分主要包括环烯醚萜苷类、有机酸及其酯类、五环三萜类、鞣质、多糖等，其中以莫诺苷、马钱苷为代表的环烯醚萜苷类及以齐墩果酸和熊果酸为主的五环三萜类化合物是山茱萸最具有生物活性的成分。5-羟甲基糠醛是一种重要的呋喃基化合物，是由单糖经美拉德反应或焦糖化反应脱水生成，性质不稳定，其体内代谢物在一定剂量下有明显的刺激性、致敏性、肾毒性、致癌性等潜在毒性[17]，同时研究发现，5-羟甲基糠醛是山萸肉炮制后保肝护肝作用增强的原因之一[18]。因此，选择熊果酸、没食子酸、齐墩果酸、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ作为山萸肉不同炮制品的待测成分。

3.2 供试品溶液提取方法选择

本研究考察超声和热回流2 种提取方法，60%、70%、80%、90%、100%不同比例的甲醇和乙腈提取溶剂，30、40、60 min 不同超声提取时间对实验的影响。结果热回流方法提取杂质峰较多，莫诺苷色谱峰后有一相邻色谱峰与其分离效果差，超声提取法提取完全、操作简便、干扰峰少；80%甲醇较其他比例提取溶剂，8 个化学成分提取率高；超声提取时间达到40 min 时，8 个化学成分均可完全溶出，延长提取时间并不能提高提取效率，故选择80%甲醇超声提取（250 W，40 kHz）40 min作为山茱萸不同炮制品供试品溶液的制备方法。

3.3 色谱条件选择

参考相关文献，本研究考察了不同梯度的乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水流动相体系对分析结果的影响[19]。结果表明，梯度洗脱较等度洗脱色谱柱压力更平稳，8 个化学成分的分离效果更好，有机相乙腈的洗脱能力优于甲醇，0.1%磷酸溶液较水作为流动相无机相色谱峰峰形更好，有效改善了色谱峰拖尾问题。故确定采用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱作为流动相系统。采用二极管子阵列检测器，在190～400 nm 对对照品和供试品溶液进行扫描，结果显示，莫诺苷等环烯醚萜苷类成分在240 nm处有最大吸收，没食子酸在218 nm处有最大吸收，5-羟甲基糠醛最大吸收波长为284 nm，齐墩果酸和熊果酸最大吸收波长为360 nm，故本研究采用波长切换法［218 nm（0～10 min，没食子酸）、284 nm（10～15 min，5-羟甲基糠醛）、240 nm（15～50 min，莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷Ⅰ）、360 nm（50～70 min，齐墩果酸和熊果酸）］研究山茱萸不同炮制品中8个化学成分的含量。

3.4 含量测定结果分析

山萸肉炮制品有效成分的含量变化与中医理论的“生熟异用”观点有较大关联。由表3 可知，酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉相对于山萸肉，莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷Ⅰ的含量均降低；而没食子酸、5-羟甲基糠醛、齐墩果酸和熊果酸的含量经酒制和醋制后均增加。相关研究发现，山萸肉经酒蒸炮制后齐墩果烷系皂苷可水解为齐墩果酸和熊果酸，因此抗病毒、抗炎和抗氧化应激作用增强；莫诺苷等环烯醚萜苷类成分经炮制后降解；山萸肉经蒸制后美拉德反应或焦糖化反应加强，5-羟甲基糠醛含量增加，以酒萸肉增加最为明显；山萸肉炮制品较山萸肉生品中没食子酸的含量增加，但炮制品间含量差异较小[20]。

4 结论

本研究建立了HPLC 同时测定山茱萸不同炮制品（山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉）中熊果酸、没食子酸、齐墩果酸、獐牙菜苷、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ8 个活性成分的含量测定方法，经方法学验证，该方法准确、专属、耐用性高、操作简单、重复性好，可为山茱萸及其炮制品的临床研究提供参考。