3个桂花品种花瓣游离态和糖苷态香气成分*

袁金梅 罗 靖 朱琳琳 席 婉 曾旭梅 熊康舜 王彩云 郑日如

(1.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 武汉 430070； 2.农业农村部华中都市农业重点实验室 武汉 430070)

香气物质是植物中广泛存在的次生代谢物，也是构成植物产品风味的关键因素(Dundarevaetal., 2013)， 在植物体内合成后存在3种形态，即释放于空气中的挥发态、贮存于植物内的游离态和糖苷态、其中糖苷态香气物质是指香气物质在糖基转移酶的作用下通过糖苷键与糖类结合形成的无香味大分子化合物(Songetal., 2018; Wuetal., 2018)。游离态和糖苷态香气物质可在植物产品的加工过程中通过加热、酶解或酸解等方法释放以提升风味，因此被认为是重要的香气前驱体(Shojietal., 2015)。如葡萄(Vitisvinefera)中有高达80%的萜类香气物质被糖基化(Friederickeetal., 2014a)，这些物质在葡萄酒发酵过程中可通过酶或酸的水解释放，形成葡萄酒中麝香型香味(Cabritaetal., 2006; Parkeretal., 2018)。在茶叶中也存在类似的现象，茶树(Camelliasinensis)新鲜叶片中所含的糖苷态芳樟醇、香叶醇和2-苯乙醇等在加工后释放出来，成为乌龙茶和黑茶典型花香香型的主要来源(Shijoetal., 2015)。在香花植物中，已有栀子(Gardeniajasminoides)(董尚胜等， 2000)、玫瑰(Rosarugosa)(姚卫蓉等， 2007)、茉莉(Jasminumsambac)(黄新安等， 2009)和水仙(Narcissustazettavar.chinensis)(钟娴， 2014)等的糖苷类香气化合物分离和鉴定。

桂花(Osmanthusfragrans)是中国传统十大名花之一，被列为重要的天然保健植物和特产经济植物(向其柏， 2008)。花香是桂花最重要的品质之一，香气物质(刘玉莲)的种类和变化规律一直是研究的热点(Heetal., 2017； Fuetal., 2017； Hanetal., 2019)。前期研究表明，桂花鲜花中包含六大类挥发态香气物质，其中萜类、C6化合物和酮类相对含量较高(Fuetal., 2019)。进一步通过气相色谱嗅闻技术(gas chromatography-olfactometry，GC-O)进行了特征香气物质鉴定，结果表明桂花中存在17种香气活性成分，除γ-萜品烯、丁酸叶醇酯和丁酸己酯外，其余14种均为单萜类化合物，包括紫罗酮、芳樟醇、罗勒烯及其衍生物(田怀香等， 2014； 邹晶晶等， 2017； Caietal., 2014)。在桂花鲜花中加入β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)后，花瓣可释放出大量香气物质(杨志萍等， 2005)。桂花中积累的游离态和糖苷态香气物质可能成为具有开发价值的香气资源库，但其种类及其变化规律尚不明晰。桂花根据花色分为丹桂、金桂和银桂品种群，其挥发态香气物质具有显著差别(邹晶晶等， 2017)。本研究选取了3个典型且常见的品种‘晚银桂’、‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’进行游离态和糖苷态香气物质的检测，旨在明确不同品种游离态和糖苷态香气物质的变化规律，为桂花的产业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以华中农业大学校园内长势良好的典型品种‘晚银桂’、‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’为材料，2019年9月在阴天上午9： 00—10： 00分别采取花瓣未展(S1)、花瓣半展开(S2)、花瓣完全展开(S3)和花瓣枯萎(S4)4个时期的花瓣迅速置于液氮速冻并在-80 ℃冰箱贮存备用。每次称取2 g花瓣进行香气提取，每组样品进行3个重复。

1.2 试剂及仪器

试剂及仪器β-D-葡萄糖苷酶、环己酮色谱纯购置于美国Sigma公司、C8-C20正构烷烃标准品购置于美国Fluka公司，戊烷、乙醚、甲醇等色谱纯试剂购置于美国Mreda公司，AmberliteXAD-2树脂柱购置于美国Supelco公司。检测仪器为Thermo DSQⅡ单四极杆气相色谱-质谱联用仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)。

1.3 试验方法

1.3.1 游离态香气物质提取 2 g花瓣采用液氮研磨后加入戊烷/乙醚(1∶1)在16 ℃下提取30 min，重复提取1次后将混合提取液用氮气吹干仪浓缩至2 mL。加入内标环己酮946 μg，并用无水硫酸钠干燥，最后用尼龙膜过滤转移至萃取瓶。

1.3.2 糖苷态香气物质提取 2 g花瓣采用液氮研磨后加入蒸馏水，4 ℃低温离心15 min。取上清液过滤后以3 mL·min-1的流速经过Amberlite XAD-2离子交换树脂吸附柱(15 mm×25 mm)，然后用40 mL去离子水过柱以去除糖、酸物质，用40 mL戊烷/乙醚(1∶1)去除游离态香气物质，接着用20 mL甲醇洗脱吸附柱上的糖苷态物质，洗脱液在旋转蒸发仪上浓缩至干燥。用2 mL 200 mmol·L-1柠檬酸和200 mmol·L-1磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)溶解，再用1 mL戊烷/乙醚(1∶1)3次萃取以去除残留的游离态香气物质，水相备用。在2 mL水溶液中加入300 μL β-D-葡萄糖苷酶(≥6 U·mg-1)，10 μL环己酮作为内标(浓度为9.46 mg·mL，溶于甲醇)，再覆盖1 mL MTBE，将反应液放入萃取瓶中。在40 ℃水浴中保温水解36 h，之后用1 mL MTBE 3次萃取酶解液，无水硫酸钠干燥，氮吹浓缩至0.5 mL，供GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS检测 按照刘偲(2015)设置条件进行，GC-MS检测所得质谱图与NIST谱库比对，同时根据科瓦茨保留指数(Kovats’ Retention Indices，RI)和文献进一步确认香气种类。保留指数由相同升温程序下正构烷烃标准样品(C8-C20)计算得到。游离态香气与糖苷态香气物质采用内标法进行定量。香气物质的定量分析采用内标法，香气各组分的含量(μg·g-1)=各组分的峰面积/内标物的峰面积×内标物含量(μg)/样品量(g)×f(f为各组分对内标物的校正因子，f=1)。

1.4 数据统计与分析

每个样品进行3个生物学重复试验，计算平均值和标准误，同时采用SPSS软件的单因素方差分析(one-wayANOVA)统计数据差异。

2 结果与分析

2.1 3个品种花瓣完全展开期(S3)游离态和糖苷态萜类香气物质比较

萜类化合物是桂花最为重要的特征香气物质，是决定桂花香味浓郁度和香型的决定性因素。这类物质不仅广泛存在于挥发态香气物质中，还以游离态和糖苷态形式大量贮存于植物组织内。3个品种的游离态和糖苷态萜类香气物质包括单萜、单萜醇、单萜酮和单萜氧化物四大类。游离态和糖苷态中均存在的香气物质包括芳樟醇、芳樟醇氧化物、二氢-β-紫罗酮和4-羟基-β-紫罗酮等，说明部分游离态香气物质可直接转化为糖苷态香气物质。同时，游离态和糖苷态成分也有明显差别，游离态中特有单萜类物质D-柠檬烯、顺式-β-罗勒烯，单萜酮α-紫罗酮和香叶基丙酮，单萜醇2,6-二甲基-1,7-辛二烯-2,6-二醇和2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3,6-二醇； 而糖苷态特有大分子单萜衍生物，包括8-羟基芳樟醇、3-氧代-α-紫罗醇、二氢-3-氧代-β-紫罗醇、2,4,4-三甲基-3-(3-氧代丁基)环己烯-2酮。由此可见，单萜类物质经过氧化、羟基化等反应后更易发生糖苷态转化。

3个桂花品种花瓣完全展开期(S3)的游离态萜类香气物质的成分相近，但其含量差异显著(表1)。其中‘潢川金桂’的游离态萜类香气物质最高，达到254.03 μg·g-1FW，是含量最低的‘橙红丹桂’的3.8倍。在游离态物质中单萜含量最低，单萜醇和单萜氧化物含量相近，单萜酮的含量较高。‘晚银桂’和‘潢川金桂’的游离态萜类物质种类基本一致，与‘橙红丹桂’差异最大的为单萜酮。‘晚银桂’和‘潢川金桂’具有4种游离态单萜酮，包括香叶基丙酮、α-紫罗酮、二氢-β-紫罗酮和反式-β-紫罗酮，总含量分别达到135.51和104.19 μg·g-1FW； ‘橙红丹桂’仅有1种游离态单萜酮反式-β-紫罗酮，含量仅为13.08 μg·g-1FW。3个品种的游离态单萜氧化物均为芳樟醇氧化物，其中含量最丰富的为8-羟基芳樟醇。

表1 桂花‘晚银桂’、‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’花瓣完全展开期(S3)游离态萜类香气物质种类与含量①Tab.1 The volatile components categories and their contents in the full-blossoming period(S3)of Osmanthus fragrans ‘Wan Yingui’, ‘Huangchuan Jingui’ and ‘Chenghong Dangui’

由表2可知，糖苷态萜类香气物质仅有单萜醇、单萜酮和单萜氧化物三类，与游离态相比缺少了单萜类物质。3个品种的游离态萜类香气成分基本一致但含量差异显著。糖苷态萜类香气物质含量最高的为‘晚银桂’，可达378.1 μg·g-1FW，是含量最低的‘橙红丹桂’的2.19倍。在‘晚银桂’和‘潢川金桂’中含量最高的物质为单萜酮，最低的物质为单萜氧化物； 而在‘橙红丹桂’中正相反。与游离态物质规律相似，‘晚银桂’和‘潢川金桂’中均富含紫罗酮及其衍生物，显著高于‘橙红丹桂’，其中‘晚银桂’中的糖苷态4-羟基-β-紫罗酮高达186.43 μg·g-1FW。‘橙红丹桂’中糖苷态芳樟醇及其衍生物含量为99.78 μg·g-1FW，而‘晚银桂’和‘潢川金桂’仅有15.56和15.25 μg·g-1FW。由此可见，在‘潢川金桂’和‘晚银桂’中的非挥发态类胡萝卜素裂解产物紫罗酮及其衍生物显著高于‘橙红丹桂’； 相反，‘橙红丹桂’中的非挥发态芳樟醇及其衍生物显著高于‘潢川金桂’和‘晚银桂’。这与挥发态规律相似，类胡萝卜素是否发生裂解是导致品种间香气差异的重要因素。

表2 桂花‘晚银桂’、‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’花瓣完全展开期(S3)糖苷态萜类香气物质种类及含量Tab.2 The glycosylated volatile categories and their contents in the full-blossoming period(S3) of O. fragrans ‘Wan Yingui’, ‘Huangchuan Jingui’,and‘ChenghongDangui’

2.2 3个桂花品种花瓣开放过程中游离态和糖苷态香气物质变化规律

3个品种的游离态物质包括单萜、单萜醇、单萜酮、单萜氧化物、芳香族类化合物、酯类、烷烃类和其他香气物质等8类(图1A，C，E)； 糖苷态物质包括单萜醇、单萜酮、单萜氧化物、芳香族类化合物、酯类和其他香气物质等，缺少单萜和烷烃类物质(图1B，D，F)。从含量来看，3个品种的糖苷态香气物质含量显著高于游离态香气物质。‘晚银桂’‘潢川金桂’‘橙红丹桂’的花瓣完全展开期(S3)糖苷态香气物质含量分别达到683.75、698.78、582.47 μg·g-1，高于相应的游离态香气物质50.68%、60.81%、94.27%。3个品种的游离态香气物质含量均先升高后降低，在花瓣半展开期(S2)或完全展开期(S3)达到最大值(图1A，C，E)； 3个品种的糖苷态香气物质含量则逐步升高，在花瓣枯萎期(S4)积累量达到最大值。‘晚银桂’中的游离态香气物质最为丰富，‘潢川金桂’中糖苷态香气物质最为丰富(图1)。

图1 3个桂花品种不同花期游离态和糖苷态香气物质变化规律Fig. 1 Variation of free and glycosylated aroma compounds in three O. fragrans cultivars at different blossoming periods‘晚银桂’游离态(A)和糖苷态(B)香气物质，‘潢川金桂’游离态(C)和糖苷态(D)香气物质，‘橙红丹桂’游离态(E)和糖苷态(F)香气物质。S1: 花瓣未展期； S2： 半展期； S3： 完全展开期； S4： 枯萎期。不同小写字母表示同类香气物质在不同花期的差异显著性(P<0.05)。每个样品3个生物学重复。Free(A) and glycosylated(B) aroma compounds in ‘Wan Yingui’, free(C) and glycosylated(D) aroma compounds in ‘Huangchuan Jingui’, free(E) and glycosylated(F) aroma compounds in ‘Chenghong Dangui’. S1： The flowers of not blossoming period; S2: Initial blossoming period; S3: Full blossoming period; S4: Late blossoming period. Different small letters indicate significant difference at 0.05 level between the same type of aroma compounds from different blossoming periods. Each sample contains three biological repeats.

在游离态香气物质中，3个品种的单萜及其衍生物比例均明显高于其他香气物质，如‘晚银桂’中的单萜类物质在花瓣完全展开期(S3)占所有香气物质的42.66%，而酯类和芳香族化合物仅为24.85%和12.99%(图1A)。除了单萜类物质以外，游离态中含有丰富的酯类香气物质，尤其是桂花特征香气物质γ-癸内酯，在‘晚银桂’‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’花瓣完全展开期(S3)含量分别达到54.68、75.1和73.15 μg·g-1FW，而在糖苷态物质中则仅能检测到微量酯类香气物质。

在糖苷态香气物质中，3个品种的香气组分有显著差异(图1B，D，F)。其中‘晚银桂’的单萜及其衍生物占花瓣枯萎期(S4)所有香气的比值高达53.6%，而‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’仅有35.61%和35.88%。在‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’中，比例最高的香气物质为芳香族类化合物，该类物质具有典型的苯环结构，结构稳定，不易分解且毒性较强。芳香族类化合物主要包括4-羟基-苯乙醇、苯氧基-2-(1,1-二甲基乙基)-3-甲基、2,4-双(1,1,-乙基)-苯酚等，含量最高的4-羟基苯乙醇在‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’的花瓣完全展开期(S3)中可高达341.35、255.85 μg·g-1FW。

3 讨论

3.1 桂花游离态、糖苷态香气物质与挥发态香气物质的关系

香味物质合成后会以挥发态的形式释放或以游离态和糖苷态的形式贮藏(Songetal., 2018)。挥发态香气物质可以有效吸引昆虫授粉(Mollyetal., 2016)，但是部分香气物质对植物本身有一定的毒性(Raguso， 2016; Songetal., 2018)，因此也可以无害的糖苷态形式贮存起来，对病菌和食草动物等起到间接防御作用(Junkeretal., 2011)。

本研究对7个桂花品种进行挥发态、游离态和糖苷态香气物质的检测表明，游离态香气物质与挥发态香气物质成分基本一致，但是在糖苷态中检测到4-羟基苯乙醇、顺式8-羟基芳樟醇等20种特有香气物质，并且这些物质在其他桂花香气研究中鲜有报道(曹慧等， 2009； 侯丹， 2015； Xinetal., 2013； Fuetal., 2019)。糖苷态香气物质中大量单萜类物质在细胞色素P450这类末端加氧酶的作用下发生氧化、环化、羟化等反应，形成一系列大分子衍生物，如各类芳樟醇氧化物、4-羟基-β-紫罗酮、3-氧代-α-紫罗醇、二氢-3-氧代-β-紫罗醇等(Boachonetal., 2015)。虽然萜类衍生物的挥发性减弱，但是易在糖基转移酶的作用下与糖基结合形成糖苷态化合物。

3类香气物质在花瓣开放过程中呈现紧密的关联。挥发态香气物质从花瓣半展开期(S2)至完全展开期(S3)显著增加，在花瓣枯萎期(S4)明显下降(Zengetal., 2015; Zhengetal., 2017)； 这与游离态香气物质变化规律相似，但糖苷态香气物质呈现持续增长的趋势，在花瓣枯萎期(S4)达到峰值(表1，表2，图1)。以芳樟醇及其衍生物为例，‘橙红丹桂’中含量较高的糖苷态香气物质顺式-8-羟基芳樟醇和反式-8-羟基芳樟醇在开花末期的糖苷化比例高达92.08%和89.54%(Zengetal., 2016)。在葡萄、柑橘(Citrus)、番茄(Solanumlycopersicum)等的研究中也发现果实成熟前香气物质主要以挥发态形式释放，果实成熟后大量香气物质转化为糖苷态形式积累(Simonaetal., 2009; D’Onofrioetal., 2017)。另外，对桂花香气的昼夜节律研究表明，挥发态香气物质从上午开始显著升高，至中午12:00释放量达到峰值，之后持续下降； 而游离态则会持续增加至18:00，随后下降； 糖苷态香气物质则持续增长至夜间(Zhengetal., 2017)。在大马士革玫瑰(Rosadamascena)中也有类似现象，2-苯基乙醇的释放主要受到糖苷态转化的影响(Piconeetal., 2004)。在中华猕猴桃(Actinidiachinensis)花中芳樟醇的含量也明显受到糖苷化8-羟基芳樟醇的调控(Greenetal.， 2012)。将芳樟醇合酶基因在矮牵牛(Petuniahybrida)花中或番茄果实中超表达后，除了显著增加挥发态芳樟醇外，还明显提高了糖苷态8-羟基芳樟醇的含量(Lewinsohnetal., 2001； Luckeretal.,2001)。以上现象说明，3种形态香气物质存在相互转化和相互影响的关系。

在植物的次生代谢中糖基化现象非常普遍，糖基转移酶可将活性糖基与香气、色素等大量配基相结合，从而改变这些小分子化合物的生物化学性质(Bönischetal., 2014)。早在1980年研究者就已明确糖基化反应能显著改变花朵和果实香味(Williamsetal.， 1980)，但直到近期才在基因组、转录组和代谢组研究的基础上在葡萄(Friederickeetal., 2014a； 2014b)、桃(Prunuspersica)(Wuetal., 2018)、美味猕猴桃(Actinidiadeliciosa)(Yar-Khingetal., 2014)、茶叶(Shojietal., 2015; Songetal., 2018)、桂花(Zhengetal.， 2019)等植物中鉴定到部分作用于香气物质的糖基转移酶。在桂花中挖掘特异催化萜类香气物质的糖基转移酶基因并明确其基因功能和酶学特性，将是深入解析糖基化反应内在分子机制的关键，也是进行花香品质调控的重要前提。

3.2 3个桂花品种香气物质的差异

3个品种游离态和糖苷态香气物质的种类相似，但是含量存在较大差异。总体来说，‘晚银桂’和‘潢川金桂’的游离态和糖苷态香气物质含量要明显高于‘橙红丹桂’。‘晚银桂’中的单萜及其衍生物含量最高，而‘潢川金桂’和‘橙红丹桂’则富含大量酯类物质。单萜及其衍生物是重要的香气活性物质，其组分决定了植物组织的香型和香味浓郁度(Caietal.,2014； Wangetal., 2009)。‘晚银桂’和‘潢川金桂’的挥发态、游离态和糖苷态香气物质中均富含反式-β-紫罗酮、α-紫罗酮、二氢-β-紫罗酮等类胡萝卜素裂解产物，呈现紫罗香、木香和果香特质； 而‘橙红丹桂’的挥发态、游离态和糖苷态香气物质主要以反式芳樟醇氧化物(呋喃型)、顺式芳樟醇氧化物(呋喃型)、8-羟基芳樟醇、反式-β-罗勒烯、芳樟醇等单萜和单萜氧化物为主，呈现花香、青草香等特质(Caietal., 2014)。从合成路径上来看，紫罗酮及其衍生物主要是通过类胡萝卜素裂解酶OfCCD1、OfCCD4裂解类胡萝卜素而产生(Baldermannetal., 2010)； 芳樟醇、罗勒烯及其衍生物等则是由香叶基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)经萜烯合成酶催化产生(Dundarevaetal., 2013； Zengetal., 2016)。两者的反应底物均来源于2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP)途径，可能是由于不同品种在MEP分支途径上的不同流量分配导致了香气差异。

3.3 桂花游离态和糖苷态香气物质的产业价值

与挥发态香气物质相比，游离态和糖苷态物质贮存在植物组织内，容易在加工过程中释放出来，成为产品的风味物质(Parkeretal., 2018)。有机溶剂萃取法是进行香味物质提取的常规步骤。通过多种有机溶剂的萃取比较研究，笔者发现戊烷和乙醚可有效提取桂花中的香气活性物质单萜及其衍生物(刘偲， 2015)。另外，采用β-葡萄糖苷酶或复合酶AR-2000水解法可有效释放贮存在花瓣中的香气物质(杨志萍等， 2005； Yar-Khingetal., 2014)。

在游离态香气物质中，3个品种均含有丰富的酯类物质γ-癸内酯，它能呈现强烈的果香味。同时，3个品种的游离态和糖苷态香气中含有大量单萜及其衍生物，这些特征香气物质不仅是鲜花的主要香气成分，也是桂花产品中的重要香气活性物质，其种类和含量对香型和香味浓郁度均起到重要作用(Wangetal., 2009； Xinetal., 2013)。其中紫罗酮及其衍生物呈现紫罗香、木香和果香特质，芳樟醇氧化物、反式-β-罗勒烯等则呈现花香、青草香等特质(Caietal., 2014)。香叶基丙酮则是具有木兰香气的名贵香料，广泛应用于日化、食品和医药行业(孙美环等， 2013)。与挥发态和游离态香气相比，4-羟基苯乙醇是桂花糖苷态中含量最高的组分，属于芳香族醇类物质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用(李军等， 2008)。综上所述，桂花除了挥发态香气物质以外，在游离态和糖苷态中均含有极富应用潜力的香气物质，通过酶解和萃取的方法对其进行提取和释放可以有效提升花卉产品的香味品质。

4 结论

本研究解析了游离态和糖苷态香气的提取和检测方法，表明有机溶剂戊烷和乙醚可以有效提取萜类香气物质，β-D-葡萄糖苷酶可以有效裂解糖苷键，促进糖苷态香气物质的释放。香气鉴定表明，3个品种的桂花中均含有丰富的萜类及其衍生物、芳香族化合物、酯类等非挥发态香气活性物质，其中在挥发态香气中未检测到的香叶基丙酮和4-羟基苯乙醇在非挥发态中大量存在，且均是有利用价值的香气物质。因此，游离态和糖苷态香气物质可以在各种桂花加工品中加以应用，提升香味品质。