外源酶辅助发酵加工藏茶的工艺研究

贾洋洋，聂枞宁，罗兴禹，杨凯辉，何春雷，2，*

(1.四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130； 2.四川省藏茶产业工程技术研究中心，四川 雅安 625000)

藏茶是我国黑茶的典型代表，较好地顺应了边疆同胞“多肉食、少果蔬”的膳食构造，成为他们的生活必需品。近年来，黑茶因其独特的保健功效而受到了广大消费者的青睐[1-2]，已成为内销的第二大茶类。渥堆在黑茶品质形成过程中起着主导性作用，在渥堆工序中，原料茶中的多酚类物质、生物碱、氨基酸以及糖类化合物在微生物胞外酶，特别是多酚氧化酶和湿热双重作用下发生了氧化、还原、聚合、降解和络合等一系列复杂的生化反应，进而形成了黑茶独有的醇和浓厚口感[3-4]。但是传统黑茶在制作过程中存在着诸多问题，例如渥堆周期长、生产效率低、卫生条件差、劳动强度高、成品茶质量参差不齐，以及微生物代谢毒素等问题[5]，已成为制约黑茶产业发展的关键，探索黑茶加工新工艺已成为茶界关注的焦点。

赵冰等[6]以普洱茶为试验原料，添加从水果中制备的外源多酚氧化酶，结果表明，处理样中的茶多酚、儿茶素、氨基酸、茶黄素、茶红素总量和酶的活性存在着显著的负相关，而茶褐素总量则显著上升。杨富亚等[7]研究发现，多种外源酶制成的复合酶制剂有效地促进了渥堆转化的过程，缩短了渥堆发酵的时间，增加了茶汤的滋味成分，促进了普洱茶风味的形成。本研究拟采用绿毛茶为原料，通过添加外源酶进行酶促氧化，结合湿热转化作用，探索藏茶加工新工艺，并以传统加工的藏茶为对照进行感官及生化成分评价，为藏茶加工探索一条新的路径。

1 材料与方法

1.1 供试茶样及主要仪器设备

本试验所用绿毛茶均为四川康润茶业有限公司提供的一芽三四叶烘青毛茶，水分含量为5.37%。

主要仪器设备：101-2电热鼓风干燥箱， 北京中兴伟业仪器有限公司；FA2004B型分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；UV754N 紫外可见分光光度计， 上海仪电分析仪器有限公司；恒温恒湿箱，北京雅士林试验设备有限公司；恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海豫康科教仪器设备有限公司；捣碎机，上海弗鲁科技发展有限公司；循环水式真空泵，北京中兴伟业仪器；SCIENTZ-18ND 冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；AXTG18G-Ⅱ台式通用高速离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 外源酶制备及其酶活性测定

外源酶的制备：将冷冻丙酮添加到洗净去皮的土豆中，在组织捣碎机中充分搅碎，然后进行抽滤，直到用冷冻丙酮洗涤过滤至无色[8-9]，冷冻干燥，即得外源酶粉。

外源酶酶液的制备：根据试验设计取一定量的外源酶酶粉溶于一定量0.5 mol·L-1pH 9.0的磷酸盐缓冲液，冰浴下搅拌20 min，4 000 r·min-1离心20 min，过滤所得上清液即为外源酶酶液。

酶活力测定：取1 g外源酶酶粉溶于100 mL 1.15 mol·L-1pH 7.0的预冷磷酸盐缓冲液中，冰浴下搅拌20 min，4 000 r·min-1离心20 min，所得上清液用来测定酶活力。将2 mL 0.1 mol·L-1邻苯二酚(溶于1.15 mol·L-1pH 7.0的缓冲液所得)加入1 mL外源酶酶液中，在420 nm波长下测定吸光度的变化，每隔10 s记录1次，直到3 min。用不加外源酶的反应液做空白对照，即每分钟吸光度变化0.01为1个酶活性单位记1 U。

1.2.2 茶坯含水量的调整和新工艺茶样的制作

参照李艳等[10]的方法将水分调整至要求。在先前单因素试验的基础上以酶添加量、发酵温度、发酵时间、茶坯含水量为试验因素，采用Box-Behnken 设计响应面分析建立数学模型，以茶叶感官审评得分为指标优化试验设计，求得最优的试验工艺参数。选取酶量(A)、发酵温度(B)、茶坯含水量(C)、发酵时间(D)设计四因素三水平响应面试验(表1)。

表1 Box-Behnken 设计因素及水平

取适量绿毛茶，以固定压强(3 MPa)蒸汽灭菌30 s，待冷却至室温，加入酶液并揉捻，使得酶液充分均匀渗入原料中；然后将茶坯置于恒温恒湿箱中，按照正交试验得出的最佳工艺参数设定下进行酶促发酵；酶促发酵转化结束后，校正温度为80 ℃，含水量30%，每5 min通风1 min，持续60 h，取出后在80 ℃烘箱干燥得新工艺成品茶。

1.2.3 传统制法茶样制备

由雅安和龙茶厂协助制作，工艺流程：绿毛茶—蒸汽处理—渥堆、翻堆—烘干—成品茶样。取同批原料毛茶，装于双层布袋中(透气透水不漏茶)；然后混入和龙茶厂传统渥堆茶堆(>2 500 kg)中，分别放置在堆心、堆面进行渥堆；每周翻堆一次，20 d后取出，在干燥箱中烘干，即传统藏茶样。

1.2.4 感官审评方法

参照GB/T 23776—2009进行感官审评。审评小组由 5 名专业评茶员组成，评分标准见表2。

表2 感官审评评分标准

1.2.5 理化指标的测定

水分测定参照GB/T 8304—2002；水浸出物测定参照GB/T 8305—2002；茶多酚总量测定参照GB/T 8313—2002；游离氨基酸总量测定参照GB/T 8314—2002；儿茶素总量按照香荚兰素比色法测定；可溶性糖总量按照蒽酮比色法测定[11]；茶色素按照比色系统分析法测定[11]；香气组分参照文献[12]方法测定。

1.2.6 GC-MS分析方法

GC条件：Agilent HB-5MS弹性石英毛细柱(30 m×0.32 nm×0.25 μm)；进样口温度240 ℃；载气为氦气，纯度≥99.999%；柱流量1.0 mL·min-1；升温程序：初始温度50 ℃保持5 min，以10 ℃·min-1升至250 ℃保持3 min。MS条件：离子源EI，电子能70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围50～600 amu；四级杆温度150 ℃；质谱传输线温度为280 ℃。

1.2.7 定性定量方法

结合标准质谱库和各香气成分的相对保留时间进行定性，香气组分含量用其峰面积与内标峰面积之比表示。

1.3 数据处理

数据采用 SPSS 20.0和Excel 2016软件统计分析，感官审评得分和理化数据方差均值的比较采用最小显著差数法(LSD)。

2 结果与分析

2.1 新工艺参数的优化结果

以酶添加量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、茶坯含水量(D)为试验自变量，以茶叶感官审评得分为响应值(Y)，试验方案及试验结果见表3。

表3 Box-Behnken 实验设计结果

其中试验号25～29为中心试验，其他的为析因试验。每项试验均重复4次，用以估计试验误差。对所得数据进行回归分析(表4)，得到感官审评得分(S)的二次回归方程：=86.64+0.053A-2.500×10-3B+3.19C-0.051D+0.030AB+0.070AC+0.020AD-0.032BC-0.020BD-0.018CD-0.97A2-0.088B2+0.50C2-0.076D2。该模型的显著性水平P<0.000 1，说明该模型显著程度高。失拟误差值P=0.549 5>0.05，说明所建回归方程与试验拟合性较高。C(茶坯含水量)的F值最大，A(酶添加量)次之，B(发酵温度)和D(发酵时间)的F值最小，说明茶坯含水量和酶添加量对茶叶感官得分的影响最大。从模拟项的P值显著性分析可知，模拟一次项C与模拟二次项A2和C2均显著(P<0.000 1)。

表4 响应面方差分析

2.2 新工艺的最佳参数确定和验证

图1是感官审评得分作为响应值的各因素交互作用曲面图。由图1可知，感官审评得分存在最大稳定点。回归模型预测的新工艺的最佳参数为酶量80 U·g-1、渥堆温度34 ℃、含水量60%、发酵时间7 h。在此条件下得到的感官审评得分的平均值是90.41，纯误差0.057%，说明测试值与理论值基本相符，分析得到的二次方程与实际情况拟合程度较好。

图1 各因素交互作用3D曲面图

2.3 新工艺的效果评价

2.3.1 二种工艺成品茶感官品质对比分析

表5表明，新工艺制作的藏茶总体品质优于传统藏茶，其表现在叶色更乌润，汤色更红浓亮，香气更纯正，滋味更浓厚回甘。

2.3.2 二种工艺茶样常规成分对比

由表6可知，水浸出物和氨基酸呈现出新工艺高于传统工艺，可能是由于没有微生物消耗的结果。茶多酚、儿茶素、可溶性糖均呈现出新工艺高于传统工艺，可能是由于发酵时间的缩短，更有利于这些成分在茶叶中的保留。酚氨比是茶汤滋味醇和与否的重要指标[13-14]，而水浸出物在一定程度上可以反映茶汤的滋味的浓强度和厚薄，氨基酸可以协调茶汤的滋味关系[15]。这些都表明新工艺茶样的风味品质优于传统茶样。

2.3.3 二种工艺茶样茶色素成分对比

儿茶素在酶促和湿热作用下氧化聚合生成茶色素使得茶汤变得红褐、收敛性减弱、滋味变得醇和的成分[16]。由表7可知，新工艺茶样茶褐素含量较高，这与表5中的感官特征相符合，而传统茶汤厚度不足的原因可能由于传统工艺制得茶样茶色素含量偏低造成的[17-18]。茶褐素的含量是衡量黑茶品质好坏的一个重要的指标[19-20]，有研究表明，多种酶都参与了茶褐素的形成过程，但是具体的形成机理比较复杂还需进一步的研究，这也是造成了新工艺茶样品质优于传统工艺茶样的一个重要原因。

表5 两种工艺成品茶感官审评

表6 两种工艺常规滋味成分比较表

表7 二种工艺茶色素含量比较表

2.4 二种工艺香气组分比较

由表8可知，共检测出50种香气组分，其中醛类占比22%，萜烯类占比20%，醇类占比18%，酮类占比18%，吡咯类、烷烃类及其他类占比14%，酯类占比10%。新工艺茶样中，醇类占比23.36%，醛类19.64%，萜烯类17.66%，酮类17.02%，酯类8.15%。其中，具有玉兰花香、铃兰香和木香的β-芳樟醇增加1.69百分点，具有木香花香的α-雪松醇增加0.49百分点，具有果香的香叶基丙酮增加2.27百分点，具有柠檬香的癸醛增加4.00百分点，具有玫瑰香的壬醛增加2.65百分点，具有木香的δ-杜松烯增加5.39百分点，具有花香的顺-β-罗勒烯增加0.10百分点，具有愉快香气的苯乙酮增加2.37百分点。这些果香型的香气物质改善了藏茶的风味品质，为辅助优化藏茶制作工艺提供了一定的参考[21-23]。

表8 两种工艺茶样香气物质相对比例比较

3 讨论

藏茶属于黑茶类。黑茶之所以具有褐叶红汤、陈香浓郁、醇和爽口的品质特征，是在渥堆工序中由微生物及其分泌的胞外酶和湿热综合作用下产生的。黑茶的滋味成分是以茶多酚及其氧化产物为主的一个综合体系，在这个体系中，有呈涩味的儿茶素、呈苦味的咖啡碱、呈甘甜的可溶性糖和呈鲜爽味的氨基酸。各种滋味成分相互消杀变调，相互作用，形成了黑茶特有的滋味口感。有研究表明，黑茶经过杀青和揉捻的湿热作用就使得其中的酯型儿茶素发生了水解，相对简单的儿茶素的含量升高。在而后的渥堆工序中，茶多酚总量呈明显的下降趋势，但是各种儿茶素的变化却是不同的。酯型儿茶素水解产生了简单儿茶素和没食子酸。而简单儿茶素在酶促反应和自动氧化下形成了以茶色素为主的水溶性色素，其中茶黄素、茶红素和茶褐素都是形成黑茶品质的关键成分[24-26]。黑茶的主要香气成分来自于茶叶本身芳香物质的分解、转化、异构以及渥堆工序中酶促反应。同时，黑茶的香气组分与加工工艺有着密不可分的关系，梁敏敏等[27]研究表明，以碧香早品种夏茶为原料在调整渥堆和干燥的参数的基础上结合做青工序研制出了高香型的黑毛茶。曾斌等[28]通过优化不同的二次渥堆参数促进酶促反应和湿热作用，使得黑毛茶的外形和内质都发生了更优异的品质变化。而这方面在藏茶加工工艺方面却鲜有报道。

续表8 Continued Table 8

本试验采用了从土豆中提取的外源酶辅助发酵加工藏茶。结果表明，人为添加外源酶也能促进渥堆工序中茶多酚、儿茶素的氧化等反应，形成藏茶的品质。新工艺制法仅用时60 h，而茶样发酵程度与传统工艺(20 d)近乎一致，说明新工艺可有效加快绿毛茶向黑茶的转化进程，从而避免了黑茶在传统制作过程中由于带来微生物真菌的污染[5]、品质安全不可控、质量参差不齐等问题。并且土豆中提取的外源酶，成本低，还不受季节限制，有可以推广的实际价值，为后续的藏茶加工生产提供参考依据。

氨基酸既是茶汤鲜爽味的呈味物质，又是形成黑茶香气物质的前提物质[29]，可以有效地协调茶汤各种滋味成分，与茶汤的品质有着显著的正相关。可溶性糖能有效地缓解茶汤中生物碱和多酚类地苦涩味和刺激性作用[30]。新工艺和传统渥堆中的酶促反应都可以促进氨基酸和可溶性糖的增加，但是传统渥堆中由部分微生物进行生长代谢需要消耗相关的氮源和碳源，这也可能是新工艺茶样中的糖和氨基酸高于对照样的原因。水浸出物是溶于茶汤中的一切呈味物质的总和，在一定程度上可以决定茶叶品质质量的高低。

与传统茶样对比，新工艺茶样的氨基酸，可溶性糖和水浸出物均高于对照样，这也表明了新工艺的茶样的品质优于传统茶样。感官审评结果表明，新工艺茶样带有花香、甜香，汤色更橙红明亮，滋味更醇和浓厚，这也与生化成分测定的分析是一样的，酚氨比低于对照样，其他成分高于对照样。充分证明新工艺可有效地改善藏茶的外形，香气，滋味和叶底，提高藏茶品质。

4 总结与展望

传统藏茶加工工艺：鲜叶—摊放—杀青—揉捻—渥堆—干燥。而综合整个试验结果，外源酶辅助发酵加工藏茶的新工艺的较佳工艺参数为酶量80 U·g-1、渥堆温度34 ℃、含水量60%、发酵时间7 h，即酶辅助新工艺流程为：绿毛茶—加入酶液—酶辅助发酵—湿热转化—烘干—成品茶样。此条件下加工的藏茶茶样具有明显的陈香及独特香气，极大地改善了传统黑茶的陈味及霉味。新工艺目前在生化试验阶段中取得了突破性的进展，如若想广泛地应用到实际的大生产当中还需要进行进一步的优化和探究。