长期秸秆还田下土壤反硝化细菌群落的有机碳驱动机制

贾生强，范惠珊，陈喜靖，喻 曼，沈阿林，苏 瑶，*

(1.浙江农林大学 环境与资源学院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省农业科学院 环境资源与土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021)

秸秆占作物总生物量的50%～80%，含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等营养物质，是一种能直接利用的可再生资源[1]。据统计，我国秸秆年产量在10亿t左右，直接还田是目前我国秸秆资源化利用最主要的方式[2]，其比例在2016年已超过50%。秸秆还田可改善土壤结构，提高土壤肥力[3-6]，增加土壤微生物量并提高其活性[7-8]，具有促进农民增产增收、维持土壤健康的重要作用。高碳氮比的作物秸秆加入土壤后，将与土壤原有的碳库和氮库发生复杂的生物化学和物理化学作用，这些作用会极大地影响土壤微生物的多样性，改变土壤碳、氮循环[9-11]。

反硝化作用是土壤氮循环的重要环节，也是我国农业生态系统氮损失的主要途径之一[12]。据统计，由土壤生物反硝化途径造成的农业生态系统氮损失可达35.0%～52.0%[12]。研究证实，秸秆还田可增加土壤反硝化细菌功能基因nirS、nirK和nosZ的拷贝数，并提高反硝化活性[13-16]。主要原因包括：(1)秸秆还田增加土壤微生物活性，进而加快对土壤氧的消耗，为土壤生物反硝化作用创造有益的缺氧或厌氧环境；(2)还田秸秆碳转化过程形成的土壤有机碳，包括溶解性有机碳(DOC)、易氧化态有机碳(EOC)、微生物生物量碳(MBC)、颗粒有机碳(POC)和矿物结合态有机碳(MOC)等，为土壤中的反硝化微生物提供了更多的可利用碳源，进而促进反硝化微生物的生长，增强其活性[14，17]。有研究发现，部分反硝化微生物，如Bradyrhizobium(慢生根瘤菌属)、Burkholderia(伯克氏菌属)、Burkholderia-Paraburkholderia、Paraphaeosphaeria等直接参与秸秆碳的同化，同时引起土壤无机氮水平的变化[18-19]。可见，土壤碳组分的迁移与转化已成为秸秆还田下土壤反硝化微生物发展的重要驱动因子。现有研究表明，秸秆添加后180 d内，土壤活性有机碳组分与土壤微生物活性在秸秆添加后7～14 d先迅速上升，之后将逐渐减少至与无秸秆添加处理相当的水平[20-21]。其中，土壤DOC和EOC是影响耕层土壤反硝化微生物群落的重要有机碳组分[22]。长期秸秆还田条件下，秸秆碳转化形成的土壤有机碳可通过迁移影响更深层土壤[23-24]，进而对各土层反硝化微生物的丰度与多样性产生影响。但是，目前关于长期秸秆还田下不同深度土壤有机碳库变化对土壤反硝化微生物种群结构影响的认识还较为有限，而对这部分内容的掌握，有助于探明秸秆还田引起的土壤有机碳组分变化如何驱动土壤可利用氮水平的改变，对于准确揭示秸秆还田下的土壤肥力变化机制和土壤碳氮循环耦合关系具有科学意义。

本研究利用5 a的定位试验，分析秸秆还田对0～100 cm土层不同有机碳、氮组分含量，及土壤反硝化微生物丰度和种群结构的影响，采用相关性分析、冗余分析等方法，探究驱动土壤反硝化微生物多样性和群落组成变化的主要有机碳组分，以期阐明长期秸秆还田下土壤反硝化细菌群落的有机碳驱动机制，为揭示秸秆还田下土壤碳氮转化的耦合关系提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2015年6月—2020年6月在浙江省金华市婺城区蒋堂镇黄碧垄村某试验地(29°1′19.9″N，119°26′13.11″E)进行。该试验地地势西南和东北高，分别为仙霞岭余脉和龙门山脉的支脉，多中、低山，属亚热带季风气候，年平均气温17.3～18.2 ℃，全年总降水量在1 109.0～1 305.2 mm，实行水稻-油菜轮作的一年两熟制。试验地土壤类型为黄筋泥发育的水稻土，耕作层初始土壤pH值为6.55，有机质含量32.1 g·kg-1，全氮含量1.24 g·kg-1，碱解氮含量193.39 mg·kg-1，有效磷含量5.98 mg·kg-1，速效钾含量72.5 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验设2个处理，即秸秆不还田(对照，CK)和秸秆全量还田(SF)。SF处理中，水稻秸秆还田量约为8 100 kg·hm-2，油菜秸秆还田量约为6 150 kg·hm-2，还田深度为0～20 cm；CK处理中，两季作物的秸秆全部移出。每个处理设置3次重复，完全随机分布。每小区面积20.25 m2(2.7 m×7.5 m)，小区间用田埂隔开。

各处理的施肥方法与施肥量一致：水稻季的氮肥施用量(折纯，以N计，下同)为225 kg·hm-2，其中，基肥、分蘖肥和穗肥的比例分别为40%、30%和30%；钾肥施用量(以K2O计，下同)为108 kg·hm-2，分蘖肥和穗肥各占50%；磷肥施用量(以P2O5计，下同)为67.5 kg·hm-2，做底肥一次性施入；油菜季的氮肥施用量为51.75 kg·hm-2，磷肥施用量为60 kg·hm-2，均做底肥一次性施入，钾肥施用量为112.5 kg·hm-2，按基追比4∶6的比例施用，在越冬期追一次肥。其他田间管理措施均同当地农民习惯一致。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 样品采集

油菜收获后，分别采集各试验小区0～20、20～40、40～60、60～80、80～100 cm分层土样，每小区采集5个点，按层次混合均匀后放入预先准备好的冰盒。新鲜样品用于土壤MBC、铵态氮和硝态氮含量测定；部分土样于4 ℃冰箱保存，用于测定土壤DOC含量；另一部分土样于-20 ℃冰箱保存，用于DNA提取；剩余土样自然风干后过筛，用于测定土壤总有机碳、全氮、碱解氮、POC等含量；MOC含量由土壤总有机碳和POC含量相减得到。

1.3.2 土壤碳氮组分测定

土壤DOC的测定采用去离子水浸提法[25]；土壤MBC的测定采用氯仿熏蒸浸提法[26]；土壤POC的测定采用六偏磷酸钠分散法[21]。土样风干后研磨过筛，用有机元素分析仪(Vario Isotope Cube，德国Elementar)测定土壤总有机碳与全氮含量。土壤碱解氮采用碱解扩散法测定[27]。取适量土样，以2 mol·L-1KCl在200 r·min-1条件下振荡浸提(浸提液与土样的体积质量比为5∶1)1 h，离心过滤后，采用连续流动分析仪(Auto Analyzer 3，德国Bran+luebbe)测定土壤铵态氮和硝态氮含量[28]。

1.3.3 反硝化微生物丰度与群落组成分析

称取1.0～1.5 g土壤样品，按照土壤DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®soil DNA kit，OMEGA)说明书方法进行样品DNA提取；使用Nanodrop 2000UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific，USA)检测提取DNA的浓度和纯度。采用特异性引物(表1)，对反硝化细菌功能基因nirS、nosZ和nirK的拷贝数进行检测分析，定量PCR扩增条件如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃修复延伸8 min[29-31]。

表1 荧光实时定量PCR扩增引物

应用Illumina MiSeq测序仪平台(MiSeq，美国Illumina)对nirS基因进行测序。高通量测序步骤与数据质控参见文献[32]，将质控后的序列在FunGene平台[33]上进行翻译，去除不能翻译成亚硝酸盐还原酶的序列，将剩余的高质量序列在UPARSE平台[34]按97%的相似性聚类成OTU(运算分类单元)。对比GenBank数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息。

1.4 数据分析

试验所得数据采用Excel 2013、Origin 2017和R语言软件进行处理和图表绘制；使用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析和皮尔逊(Pearson)相关性分析，对于单因素方差分析中有显著(P<0.05)差异的，采用Tukey法进行多重比较；采用Canoco 4.5软件进行冗余分析。

2 结果与分析

2.1 秸秆还田后土壤各有机碳组分的变化

不同有机碳组分在各深度土层中均存在显著(P<0.05)差异，且其含量整体表现出随土层深度增加而降低的趋势(图1)。与CK相比，秸秆还田显著(P<0.05)降低0～40 cm土层的DOC和0～60 cm土层的MBC含量，降幅分别为68.89%～75.93%和35.58%～75.43%，其中，耕层(0～20 cm)土壤DOC和MBC含量分别减少68.73%和35.59%。相反地，秸秆还田后土壤POC和MOC含量分别在0～40 cm和20～60 cm土层显著(P<0.05)高于CK，增幅分别在45.69%～142.75%和89.34%～272.68%。由此可知，本试验中连续5 a的秸秆还田有利于0～60 cm土层POC和MOC的积累，但对60～100 cm土层未形成显著影响，这可能与还田年限和有机碳组分的纵向迁移强度有关。

柱右侧无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。DOC，溶解性有机碳；MBC，微生物生物量碳；POC，颗粒有机碳；MOC，矿物结合态有机碳。下同。

2.2 秸秆还田后土壤氮组分的变化

与CK相比，SF处理显著(P<0.05)增加0～80 cm土层全氮含量(图2)，增幅为14.26%～90.34%，但显著(P<0.05)降低0～20 cm土层铵态氮含量(降幅为24.8%)，以及0～60 cm土层碱解氮和硝态氮含量(降幅分别为12.99%～67.80%和12.91%～61.86%)，其中，78.57%和63.81%的碱解氮和硝态氮损失发生在0～40 cm土层。基于所测土壤碱解氮与硝态氮的含量变化初步估算，在本试验土壤条件和种植模式下，连续5 a的秸秆还田可引起的0～40 cm土层碱解氮和硝态氮损失量分别约为173.90、10.33 kg·hm-2。由此可知，长期秸秆还田虽然可增加土壤全氮含量，但也会增加耕作层和亚耕作层土壤的有效氮损失，这可能与土壤微生物增加对氮素的利用有关。不过，SF处理40～60 cm土层的铵态氮含量显著(P<0.05)高于CK处理，可能与该土层的硝化活性减弱而固氮活性增强有关。

TN，全氮；AN，碱解氮；铵态氮；硝态氮。下同。

相关性分析结果(图3)显示，土壤全氮含量与土壤POC和MOC含量呈极显著(P<0.01)正相关，表明秸秆还田后0～60 cm土层POC和MOC的有效积累是促进土壤全氮含量增加的主要原因。

2.3 秸秆还田对反硝化微生物丰度的影响

对0～60 cm土层样品进行DNA提取，分析样品中nirS、nirK和nosZ的基因拷贝数(图4)，发现其均随土层深度的增加而减少。与CK相比，SF处理显著(P<0.05)增加0～40 cm土层nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数，分别增加2.91～5.97、2.50～5.11和2.71～6.70倍；但在40～60 cm土层，nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数在2个处理间无显著差异。上述结果表明，秸秆还田可显著增加0～40 cm土层中反硝化细菌的丰度，但对40～60 cm土层的反硝化细菌丰度无显著影响。

图4 秸秆还田(SF)和不还田(CK)处理不同土层的nirS、nirK和nosZ基因拷贝数

对各土层反硝化细菌功能基因拷贝数与土壤有机碳、氮组分做相关性分析(表2)。在0～20、40～60 cm土层，除nirS基因拷贝数与土壤碱解氮含量在0～20 cm的相关性未达到显著水平外，nirS、nirK和nosZ基因拷贝数与土壤DOC、MBC和碱解氮含量呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)负相关，与全氮含量呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关；在20～40 cm土层，nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数与土壤DOC、MBC、硝态氮、碱解氮含量呈极显著(P<0.01)负相关，与MOC、POC和全氮含量呈极显著(P<0.01)正相关；在20～60 cm土层，nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数与土壤MOC含量呈极显著(P<0.01)正相关。其中，土壤铵态氮含量与nirS、nirK和nosZ基因的拷贝数在0～20 cm土层呈极显著(P<0.01)负相关，在40～60 cm土层却呈极显著(P<0.01)正相关。由此可见，秸秆还田条件下，不同土层反硝化细菌的丰度受土壤有机碳库和氮组分的共同影响。

表2 不同反硝化细菌功能基因拷贝数与土壤有机质、氮组分的相关性

2.4 秸秆还田对反硝化微生物种群α多样性的影响

以反硝化细菌nirS基因为目标片段进行群落结构分析。所有样品测序共获得264 138条有效序列，每个样品9 194～19 084条，平均14 674条，在97%相似度下聚类得到1 152个OTU。各处理0～60 cm土层中nirS型反硝化细菌群落结构多样性和丰富度分析结果显示：在20～40、40～60 cm土层中，SF处理的ACE和Chao指数均显著(P<0.05)高于CK，但其Shannon指数无显著差异(表3)。上述结果表明，秸秆还田处理下nirS型反硝化细菌的种类更多，但未对nirS型反硝化细菌群落结构的均匀性产生显著影响。

表3 nirS型反硝化细菌多样性指数

主坐标分析(PCoA)结果显示，CK处理0～40 cm土层nirS型反硝化细菌群落与SF处理明显分开，但40～60 cm土层2组处理的差异减小(图5)，表明本研究中秸秆还田对土壤反硝化细菌种群结构的影响主要在0～40 cm土层，这与秸秆还田对反硝化细菌丰度的影响相符。

空心图标代表CK，实心图标代表SF，D1、D2、D3分别代表0～20、20～40、40～60 cm土层。下同。PC1，第1主成分；PC2，第2主成分。

2.5 秸秆还田对反硝化细菌群落结构的影响

试验土壤中，nirS型反硝化细菌以未分类细菌和变形菌门为主，相对丰度分别为53.55%～80.36%和22.94%～42.46%(图6)。主要种属包括unclassified_k_norank_d_Bacteria、unclassified_p_Proteobacteria(属变形菌门)、norank_p_environmental_samples、unclassified_c_Betaproteobacteria(β-变形菌纲)、Rhodanobacter(罗河杆菌属)、unclassified_o_Burkholderiales(伯克氏菌目，属β-变形菌)和Azospira(固氮螺菌属)，相对丰度分别在33.79%～59.18%、20.3%～37.52%、19.76%～28.68%、1.48%～4.52%、0.18%～0.87%、0.18%～0.49%和0.17%～0.53%。SF处理相较于CK可显著(P<0.05)增加20～40 cm土层中unclassified_c_Betaproteobacteria和unclassified_f_Rhodocyclaceae(红环菌科，属β-变形菌)的相对丰度(图7)；在40～60 cm土层，SF处理可显著(P<0.05)增加unclassified_k_norank_d_Bacteria和unclassified_o_Burkholderiales的相对丰度。这表明秸秆还田主要可以增加土壤反硝化细菌Betaproteobacteria的种群数量。

图6 不同处理0～60 cm土层nirS型反硝化细菌种群在属水平上的组成

图7 0～60 cm土层不同处理间存在显著(P<0.05)差异的nirS型反硝化菌属

进一步分析土壤有机碳、氮组分如何影响不同土层nirS型反硝化细菌的种群结构(图8)，结果显示， RD1(主成分1)和RD2(主成分2)轴对nirS型反硝化细菌种群结构变化的总解释率为74.2%，其中，RD1轴解释47.2%，RD2轴解释27.0%。土壤有机碳组分中的POC、MOC和MBC能显著(P值分别为0.002、0.006和0.012，均小于0.05)影响反硝化细菌群落组成。同时，土壤全氮、硝态氮和铵态氮含量也是显著(P值分别为0.049、0.002和0.008，均小于0.05)影响土壤反硝化细菌群落结构的因子。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 秸秆还田对土壤有机碳组分含量变化的影响

土壤有机碳储量为所有进入土壤中的有机碳与其在土壤微生物作用下分解损失量之间的差值，其存在形式与含量分布直接影响土壤肥力和作物生长[3，24]。一般认为，秸秆还田是维持和提高土壤有机碳含量的重要途径。吴玉红等[35]在研究小麦、油菜秸秆还田对汉中盆地稻田土壤碳库组分的影响时发现，与不还田相比，秸秆还田可增加0～25 cm土层有机碳和活性有机碳含量。与短期培养试验和秸秆还田结果不同，本试验发现，连续5 a的秸秆还田显著降低0～40 cm土层DOC含量，降幅为68.89%～75.93%。这与王虎等[24]研究结果相似，他们在研究3 a不同秸秆还田方式下土壤有机碳含量的变化时发现，秸秆还田显著降低0～20 cm和0～40 cm土壤DOC含量，降幅分别为28.6%～78.6%和12.3%～69.2%，其中，两季作物秸秆均还田下DOC含量下降最多(年还田量约16 500 kg·hm-2)。此外，王士超等[36]在探究秸秆还田后不同时期稻田土壤DOC的含量变化时发现，在成熟期耕层DOC含量显著降低，降幅为33.8%。长期大量秸秆还田引发土壤DOC含量显著降低的原因主要有：(1)土壤采集时间多在下茬作物收获后，即秸秆还田约150 d后，此时秸秆中大部分易分解的有机质早已被转化，土壤新增DOC基本可忽略，而长期秸秆还田促使土壤MOC含量增加，可进一步固定土壤中的DOC，从而导致DOC含量低于CK[37]；(2)大量的秸秆还田可促进土壤自身有机碳矿化分解，即正激发效应，导致DOC下降[38]；(3)秸秆还田后，土壤团聚体结构发生变化，土壤孔隙度增加，在一定程度上会促进土壤DOC随游离水向深层迁移，加剧0～60 cm土层DOC含量的损失。Poll等[39]研究也指出，秸秆碳转化形成的DOC可随土壤含水率的变化在土层中迁移，并影响土壤MBC的分布。Wang等[40]通过meta分析(荟萃分析)发现，尽管多数报道秸秆还田会增加土壤MBC，但也有研究表明秸秆还田可显著减少土壤MBC或对其无显著影响。已有研究证实，土壤MBC与DOC含量存在显著正相关关系[21]。本试验条件下，秸秆还田处理0～80 cm土层的MBC含量显著低于不还田的对照处理，这与土层中较易利用的有机碳源，如DOC含量相对较少有关[41]。秸秆还田在0～40 cm土层能够显著增加POC含量，主要来源于秸秆腐解过程释放的木质素、半纤维素等物质与土壤团聚体的结合，但这样的物理结构决定其在土壤中的纵向迁移能力弱；因此，长期秸秆还田对深层土壤POC含量的影响甚微[42]。秸秆还田能增加20～60 cm土层的MOC含量。刘思佳等[43]研究表明，秸秆还田可提高总MOC储量(增幅为4.97%)，对土壤SOC的贡献率近50.0%。这部分增加的MOC主要是秸秆碳转化过程中形成的DOC、微生物代谢中间产物、分泌物或残体吸附于土壤矿物表面所得，因此秸秆还田后MOC的空间分布变化与土壤中DOC的迁移和微生物的活动有关[24，44]，是秸秆还田实现深层土壤增碳的主要原因。

RD1，主成分1；RD2，主成分2。

3.1.2 土壤有机碳组分对氮素水平的影响

由于土壤中的氮素绝大部分以有机态的形式存在，因此秸秆还田后土壤各有机碳组分含量的空间变化会显著影响土壤氮素水平。相关性分析结果显示，土壤全氮含量与土壤POC和MOC含量存在极显著正相关，表明秸秆还田后0～60 cm土层POC和MOC的有效积累是促进土壤TN含量增加的主要原因。由此可见，秸秆还田下各土层MOC的积累对农田有机碳的固定，以及土壤总氮含量的提高具有现实意义。

3.1.3 秸秆还田下反硝化细菌种群结构的变化

3.2 结论

本试验发现，连续5 a的秸秆还田可显著影响0～60 cm土层的土壤有机碳和矿质氮含量。秸秆还田后，0～40 cm土层的POC、20～60 cm土层的MOC和0～80 cm土层的全氮含量较CK处理分别显著增加45.69%～142.75%、89.34%～272.68%和14.26%～90.34%，但0～40 cm土层的DOC和0～60 cm土层的MBC、硝态氮含量分别显著减少68.89%～75.93%、35.58%～75.43%和12.91%～61.86%。硝态氮损失主要集中在0～40 cm土层，尽管估算的5 a损失量仅约10.33 kg·hm-2，但在今后秸秆还田条件下的耕地肥力维持和提升管理中仍需对此有所考虑。

本试验中，连续5 a的秸秆还田后0～60 cm土层反硝化细菌种群丰度的增加和群落结构的变化主要受土壤POC和MOC的驱动，其中，nirS型反硝化细菌中unclassified_c_Betaproteobacteria、unclassified_f_Rhodocyclaceae、unclassified_k_norank_d_Bacteria和unclassified_o_Burkholderiales对土壤有机碳组分含量和组成的变化相对更为敏感。

综上，本试验结果表明，秸秆还田可通过改变土壤有机碳组分驱动土壤反硝化细菌生长和种群结构发生变化，进而促进土壤反硝化作用，造成土壤硝态氮损失。今后，应加强对长期秸秆还田条件下，尤其是旱地秸秆还田下土壤硝态氮损失如何影响作物氮素吸收转运的相关研究，进而指导秸秆还田条件下更高效的氮素管理。