基于高分辨质谱法的淫羊藿特征药效黄酮质谱裂解规律及新化合物鉴定研究

秦伟瀚，阳 勇，李 卿，刘 翔

重庆市中药研究院，重庆 400065

淫羊藿始载于《神农本草经》，为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(EpimediumL.)植物的干燥叶[1]。其性温，味辛、甘，归肝、肾经[2]。具有补肾壮阳、强健筋骨、祛风除湿之功效；临床多用于治疗男性不育、骨质疏松等病症[3-5]。淫羊藿物质基础已经较为明确，主要药效成分是以去甲淫羊藿素为母核的黄酮醇类衍生物，如研究报道较多的淫羊藿苷、朝藿定、淫羊藿次苷等均归为此类[6-8]。笔者通过查阅相关文献，发现该类化合物活性基团为C-3、C-7、C-4′位羟基以及C-8位的异戊烯基，通过甲基转移反应、糖基转移反应、氧化还原反应等形成了总共达54种结构活性类似的次生代谢产物[9,10]。迄今为止，对黄酮苷的质谱裂解研究已有大量报道，但没有文献将淫羊藿特征成分化学结构与质谱裂解规律相结合进行深入探讨[11-15]。本实验借助高分辨质谱法，将淫羊藿中特征药效黄酮醇归为苷元、单糖苷、二糖苷、三糖苷和四糖苷5类进行解析研究。该实验结果有助于此类成分的定性定量分析以及新化合物的结构鉴定，为进一步明确淫羊藿的药效物质基础和生物合成规律提供科学依据。

1 仪器与材料

LC-30A型超高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；Triple TOFTM4600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪(美国，AB公司)；JY92-ⅡD型超声波细胞粉碎机(中国，宁波新艺超声设备有限公司)；HK-02A型高速中药粉碎机(中国，广州赛豪机械有限公司)；JM-20D-40型超声波清洗机(中国，洁盟清洗设备有限公司)；AUW220型万分之一分析天平(日本，岛津公司)。

对照品淫羊藿苷(批号：489-32-7)、淫羊藿次苷I(批号：56725-99-6)、淫羊藿次苷II(批号：113558-15-9)、朝藿定A(批号：110623-72-8)、朝藿定B(批号：110623-73-9)、朝藿定C(批号：110642-44-9)、箭叶淫羊藿苷B(批号：118525-36-3)、2′′-鼠李糖淫羊藿次苷II(批号：135293-13-9)、宝藿苷II(批号：55395-07-8)、淫羊藿属苷A(批号：39012-04-9)、去甲淫羊藿素(批号：28610-31-3)、脱水淫羊藿素(批号：116554-17-5)、茂藿苷A(批号：20872-01-4)、宝藿苷V(批号：118544-18-6)、粗毛淫羊藿苷(批号：143601-07-4)，质量分数均大于98%，均购于成都埃法生物科技有限公司；乙腈(色谱级，德国Merck公司)、甲酸(色谱级，美国ACS公司)，其余试剂为分析纯；水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。不同品种淫羊藿样品均采自于重庆、四川、贵州、湖南等地，经重庆市中药研究院生药研究所刘翔副研究员鉴定为小檗科多年生草本植物淫羊藿的地上部分。54批样品信息见表1。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱温30 ℃；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，体积流量0.2 mL/min；梯度洗脱：0～1.0 min，7%乙腈；1.0～7.0 min，7%→55%乙腈；7.0～11.5 min，55%→88%乙腈；11.5～13.0 min，88%乙腈；13.0～13.1 min，88%→7%乙腈；13.1～15.0 min，7%乙腈；进样量2 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式采集数据，喷雾电压(IS)：+5 500 V；雾化气压力(GS1)：0.40 MPa；气帘气压力(CUR)：0.12 MPa；辅助气压力(GS2)：0.35 MPa；离子源温度(TEMP)：550 ℃；簇裂解电压(DP)：50 V；碰撞能量(CE)：40 eV；碰撞能量区间(CES)：15 eV；检测模式为IDA(信息关联采集模式)，多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)为触发二级的条件，满足该条件优先进行二级扫描。

2.3 供试品溶液制备

精密称取淫羊藿样品粉末0.1 g，置5 mL EP管中，精密加入70%的甲醇水溶液2 mL，浸润1 h后称定重量，超声波细胞破碎处理(功率：800 W)25 min，放冷，再次称定重量，用70%甲醇溶液补足减失重量，混匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过于进样瓶中，即得。

2.4 样品数据分析处理

根据淫羊藿化学相关文献，构建以去甲淫羊藿素为母核的已知化学成分数据库。应用PeakView软件提取分析高分辨质谱采集的不同品种批次样品数据，将满足质量误差小于5 ppm、同位素分布正确且含有二级碎片的离子作为目标化合物，结合软件Formula Finder、Mass Calculators等功能、在线数据库(SciFinder、Reaxys、ChemSpider、Metlin、HMDB)，进行快速的定性分析。将鉴定结果按照苷元、单糖苷、二糖苷、三糖苷、四糖苷进行归类，探讨总结该类化合物的二级质谱裂解规律，并凭借此规律进行新化合物的结构判定。

3 结果与分析

淫羊藿的特征药效黄酮是一类以去甲淫羊藿素为母核的黄酮醇衍生物，该类化合物母核的C-3、C-7位羟基、C-8位异戊烯基和C-4′位甲氧基是其活性基团，通过甲基转移反应、糖基转移反应、氧化还原反应等形成了各种活性结构类似的次生代谢产物(见图1)。据统计该类化合物共有54种，本研究采用超高效液相-高分辨质谱法在54批15个淫羊藿品种中共鉴定出了27种该类成分，其中两个被鉴定为淫羊藿的新化合物，鉴定结果见表2。样品(S6)的总离子流图见图2。

图1 淫羊藿特征黄酮醇成分次生代谢途径Fig.1 Secondary metabolic pathways of alcohol components in characteristic flavonoids of Herba Epimedii

表2 淫羊藿特征黄酮成分鉴定结果Table 2 Identification of characteristic flavonoids from Herba Epimedii

图2 样品的总离子流图Fig.2 Total ion current diagram of the sample

3.1 质谱裂解规律解析

3.1.1 苷元成分裂解规律解析

统计淫羊藿化学相关文献资料，该植物中特征黄酮醇的苷元成分共有5个，分别为去甲淫羊藿素、去甲淫羊藿苷、去甲淫羊藿黄素、脱水淫羊藿素、异去氢淫羊藿素和anhydrocicaritin。除了去甲淫羊藿苷、去甲淫羊藿黄素未被检测出以外，其它几个苷元均有质谱响应。由图2可知，去甲淫羊藿素、脱水淫羊藿素、异去氢淫羊藿素结构类似，差别仅在于O-甲基化位置不同，通过比较这几个化合物的二级谱图，可以发现C-8位异戊烯基最容易断裂，其次是甲氧基和母核C环。Anhydrocicaritin的化学结构与其它几个苷元的差异主要是C-8位异戊烯基与C-7位羟基成环，由该化合物二级质谱可知(见图2D)，环断裂后可以连续脱去烃基生成m/z311和m/z299的离子，这种碎裂方式与其它几个苷元完全不同，且其它几个苷元均是先脱异戊烯基再脱甲氧基或甲基，而anhydrocicaritin则是先脱甲氧基再断裂环状结构，这种质谱行为差异可能与C-8、C-7位基团成环后的化学结构更加稳定有关。

3.1.2 单糖苷成分裂解规律解析

淫羊藿植物中含异戊烯基黄酮醇的单糖苷成分共报道有12个，本研究鉴定出了7个。由图3可知，这7个单糖苷化合物含有C-3位的鼠李糖苷或C-7位的葡萄糖苷，通过比较二级谱图可以发现单糖苷的碎裂规律为C-3、C-7位的糖苷键首先断裂，之后即是脱掉C-8位异戊烯基和C-4′位的甲氧基。但茂藿苷A(见图3G)、淫羊藿素-3-O-α-鼠李糖苷(见图3F)的C-8位异戊烯基双键被水加成还原，形成一个带有羟基的结构，在质谱碎裂中表现为糖苷键断裂后C-8位异戊醇基脱水后再脱烃基。粗毛淫羊藿苷(见图3C)的C-8、C-7位成环之后再脱氢形成双键并与母核A环的双键共轭，因此该环状结构比异戊烯基更加稳定，所以粗毛淫羊藿苷在C-3位鼠李糖苷脱掉后，C-4′位再脱掉一个甲基，且二级质谱中没有发现异戊烯基断裂产生的离子碎片。

图3 苷元化合物的质谱裂解规律图Fig.3 Fragmentation patterns of aglycones by mass spectrometry注：A：去甲淫羊藿素；B：脱水淫羊藿素；C：异去氢淫羊藿素；D：Anhydrocicaritin。Note:A:Desmethylicaritin;B:Anhydroicaritin;C:Isoanhydroicaritin;D:Anhydrocicaritin.

3.1.3 二糖苷成分裂解规律解析

淫羊藿植物中含异戊烯基黄酮醇的二糖苷成分共报道有17个，本研究鉴定出了7个。由图4可知，鉴定出的二糖苷化合物均在C-3和C-7位键合有葡萄糖苷、鼠李糖苷和木糖苷，C-8位键合有一个异戊烯基，C-4′位或有一个甲氧基。通过比较二糖苷化合物的化学结构，可以发现C-3位羟基只与鼠李糖苷直接相连，C-7位羟基只与葡萄糖苷直接相连，且C-3、C-7位均有同时键合两个糖苷的情况(大花淫羊藿苷F、粗藿苷、箭叶淫羊藿苷B、2′′-鼠李糖基淫羊藿次苷II)。通过比较上述化合物的二级质谱，发现二糖苷化合物的裂解规律为C-3位的糖苷键首先会由外至内的进行断裂，其次是断掉C-7位的糖苷键，之后则是脱掉C-8位的异戊烯基和C-4′位的甲氧基。造成此质谱行为的原因可能与该类化合物的构象及化学键的键能等因素相关。

图4 单糖苷化合物质谱裂解规律图Fig.4 Fragmentation patterns of monosaccharide compounds by mass spectrometry注：A：宝藿苷II；B：淫羊藿属苷C；C：粗毛淫羊藿苷；D：淫羊藿次苷II；E：淫羊藿次苷I；F：淫羊藿素-3-O-α-鼠李糖苷；G：茂藿苷A。Note:A:Baohuoside II;B:Epimedoside C;C:Acuminatin;D:Icariside II;E:Icariside I;F:Icaritin-3-O-α-rhamnoside;G:Maohuoside A.

3.1.4 三糖苷成分裂解规律解析

淫羊藿植物中含异戊烯基黄酮醇的三糖苷成分共报道有17个，本研究鉴定出了6个。由图5可知，鉴定出的三糖苷化合物均在C-3和C-7位键合有葡萄糖苷、鼠李糖苷和木糖苷，C-8位键合有一个异戊烯基，C-4′位或有一个甲氧基。通过比较三糖苷化合物的化学结构，可以发现与二糖苷相同的是C-3位羟基只与鼠李糖苷直接相连，C-7位羟基只与葡萄糖苷直接相连，但C-7位没有同时键合两个糖苷的情况。对比三糖苷化合物的二级质谱，发现三糖苷化合物的裂解规律与二糖苷一致，均为C-3位的糖苷键首先会由外至内的进行断裂，其次是断掉C-7位的糖苷键，之后则是脱掉C-8位的异戊烯基和C-4′位的甲氧基。但朝藿定I与其它三糖苷化合物结构上略有不同(见图5F)，有一分子的乙酰基连接在了鼠李糖苷上，结合二级质谱分析发现，该化合物在脱掉C-3位葡萄糖苷之后会先脱掉乙酰基再脱掉鼠李糖苷。这也提示含有乙酰基的该类成分，在质谱行为中其酯键会先于所连糖苷的糖苷键发生断裂。

图5 二糖苷化合物质谱裂解规律图Fig.5 Fragmentation patterns of diglycoside compounds by mass spectrometry注：A：大花淫羊藿苷F；B：箭叶淫羊藿苷B；C：淫羊藿属苷A；D：Hexandraside E；E：2′′-鼠李糖基淫羊藿次苷II；F：淫羊藿苷；G：粗藿苷。Note:A:Ikarisoside F;B:Sagittatoside B;C:Epimedoside A;D:Hexandraside E;E:2′′-O-Rhamnosylicariside II;F:Icariin;G:Cuhuoside.

3.1.5 四糖苷成分裂解规律解析

淫羊藿植物中含异戊烯基黄酮醇的四糖苷成分仅报道2个(二叶淫羊藿苷C、粗毛淫羊藿苷)。本研究鉴定出了粗毛淫羊藿苷，由图6可知，粗毛淫羊藿苷的C-3位键合了2个鼠李糖苷，C-7位键合了2个葡萄糖苷，C-8位有一个异戊烯基，C-4′位有一个甲氧基。通过分析该化合物的二级质谱，推测四糖苷化合物的裂解规律为C-3位的糖苷键首先会由外至内的进行断裂，其次是C-7位的糖苷键由外至内的进行断裂，之后则是脱掉C-8位的异戊烯基。比较三糖苷与四糖苷化合物的结构可以发现，这两类成分的结构差异主要为C-7位多了1个糖苷，所以质谱裂解规律相似，至于四糖苷化合物较少的原因可能与该代谢途径的生物合成积累相关。

图6 三糖苷化合物质谱裂解规律图Fig.6 Mass spectroscopic fragmentation of triglycoside compounds注：A：宝藿苷V；B：朝藿定B；C：柔藿苷；D：朝藿定C；E：朝藿定A；F：朝藿定I。Note:A:Baohuoside V;B:Epimedin B;C:Rouhuoside;D:Epimedin C;E:Epimedin A;F:Epimedin I.

3.2 基于质谱裂解规律的新化合物可能结构鉴定

3.2.1 新化合物M1的可能结构鉴定

保留时间为7.92 min的化合物M1，分子式为C35H42O16，[M+H]+的实际测量值为719.255 5，理论值为719.254 5，误差为1.4 ppm，由质谱二级碎片图(见图7)可知m/z为719.261 6的母离子连续脱去188.069 5、162.055 5、56.063 1 Da生成m/z531.192 1、m/z369.136 6、m/z313.073 5的碎片离子。再由m/z为189.078 0的离子连续脱去18.011 1、42.011 0、18.010 8 Da生成m/z171.066 9、m/z129.055 9、m/z111.045 1的碎片离子。通过PeakView软件的Mass Calculators功能计算出C8H12O5、C6H10O5、C4H8、H2O、C2H2O的精确质量数分别为188.067 93、162.052 28、56.062 05、18.010 02、42.010 02 Da，与上述脱去碎片差值均小于0.01 Da，表明该化合物可能存在鼠李糖苷、乙酰基、葡萄糖苷、异戊烯基、羟基的结构。

参考淫羊藿化学相关文献，化合物M1仅与朝鲜淫羊藿属苷Ⅱ、箭叶淫羊藿苷C为同分异构体。由图8可知，此两化合物的葡萄糖苷均键合在C-3位的鼠李糖苷上，根据该类化合物质谱裂解规律，C-3位上的糖苷键会由外向内依次断掉。由此推测朝鲜淫羊藿属苷Ⅱ、箭叶淫羊藿苷C会先脱掉葡萄糖苷，即先脱掉162的碎片。而M1则是先脱掉1个含乙酰基的鼠李糖苷，再脱掉1个葡萄糖苷，表明该化合物的葡萄糖苷没有键合在C-3位上，而是键合在C-7位的羟基上。由二级谱图(见图7B)可知M1含有m/z189的离子碎片，经过软件计算，该碎片是由一分子鼠李糖和一分子乙酰基组成，同时也证明乙酰基是连在C-3位的鼠李糖苷之上。将该化合物结构信息代入SciFinder、Reaxys等在线数据库进行检索，未匹配到与M1相一致的化学结构，故推测其为淫羊藿的新化合物。

图7 四糖苷化合物粗毛淫羊藿苷质谱裂解规律图Fig.7 Mass spectroscopic analysis of acuminatoside from tetraglycoside

图8 新化合物M1的提取离子图和二级裂解规律图Fig.8 Extraction ion diagram and secondary cracking diagram of a new compound M1注：A：提取离子图；B：二级裂解规律图。Note:A:Extracted ion map;B:Secondary cracking pattern.

3.2.2 新化合物M2的可能结构鉴定

保留时间为7.21 min的化合物M2，分子式为C45H60O24，[M+H]+的实际测量值为985.351 3，理论值为985.354 7，误差为3.4 ppm，由质谱二级碎片图(见图9)可知m/z为985.369 8的母离子连续脱去162.057 7、146.059 1、146.060 2、162.055 3、56.063 3 Da生成m/z823.312 1、m/z677.253 0、m/z531.192 8、m/z369.137 5、m/z313.074 2的碎片离子。通过PeakView软件的Mass Calculators功能计算出C6H10O5、C6H10O4、C4H8的精确质量数分别为162.052 28、146.057 36、56.062 05 Da，与上述脱去碎片差值均小于0.01 Da，表明该化合物可能存在葡萄糖苷、鼠李糖苷和乙酰基的结构。

图9 新化合物M1与同分异构体成分的结构比较图Fig.9 Structural comparison of new compound M1 with its isomer

参考淫羊藿化学相关文献，化合物M2仅与粗毛淫羊藿苷为同分异构体。由图10可知，粗毛淫羊藿苷的C-3位上键合两个鼠李糖苷，C-7位上键合两个葡萄糖苷。根据该类化合物质谱裂解规律，C-3位的糖苷键会由外向内依次断掉，之后即是C-7位的糖苷键由外向内依次断掉。由此推测粗毛淫羊藿苷会连续脱掉146、146、162、162的离子碎片，这也与该化合物的二级碎片检测结果一致(见图6)，但M2的二级质谱则是连续脱掉162、146、146、162的碎片。由该类化合物结构可知，C-3位和C-7位键合的糖苷数目没有超过2个，且C-3位只与鼠李糖苷直接相连，C-7位只与葡萄糖苷直接相连(见图11)。据此推测M2的结构中C-3位和C-7位均有一个葡萄糖苷和鼠李糖苷相连。将该化合物结构信息代入SciFinder、Reaxys等在线数据库进行检索，未匹配到与M2相一致的化学结构，故推测其为淫羊藿的新化合物。

图10 新化合物M2的提取离子图和二级裂解规律图Fig.10 Extraction ion diagram and secondary fragmentation diagram of a new compound M2注：A：提取离子图；B：二级裂解规律图。Note:A:Extracted ion map;B:Secondary cracking pattern.

图11 新化合物M2与同分异构体成分结构比较图Fig.11 Comparison of composition and structure between new compound M2 and isomer

4 讨论

淫羊藿是我国常用且重要的补益类中药材，虽然对淫羊藿的药效物质基础报道较多，但迄今没有文献对该类成分的化学结构以及质谱裂解规律进行过分析总结，不利于该类成分的定性定量分析、生物合成规律探讨以及新成分新化合物的鉴定。本研究借助高分辨质谱，通过实验对含有异戊烯基药效黄酮醇的二级质谱解析发现，该类化合物在含有ESI源质谱中首先会由外至内的断裂C-3位糖苷键及乙酰基，之后则是由外至内的断裂C-7位糖苷键及乙酰基，其后则是脱去C-8位的异戊烯基和C-4′位的甲氧基，如果C-8位异戊烯基双键被水加成还原为了异戊醇基，那么其质谱碎裂行为会先脱水再脱掉烃基，如果C-8位与C-7位基团成环，将不会产生异戊烯基的特征碎片。并借由上述裂解规律鉴定出了2个新化合物的化学结构，但高分辨质谱对同分异构体的结构鉴定能力存在一定缺陷，新化合物的化学结构还得依靠植化分离后，通过核磁共振波谱进行最终确定。据文献报道，淫羊藿植物中含异戊烯基黄酮醇成分的C-3位羟基是重要活性位点[10]，表明C-3位羟基糖苷化更易发生反应，与之相应的是在质谱行为中该位点的糖苷键也更容易断裂。糖苷键在质谱碎裂中属于异裂，即断裂时电荷不平均分配，所以该类衍生物中糖苷键的偶极矩大小或许是决定其断裂难易程度的一个重要的因素，这还有待课题组做进一步研究验证。本实验结果为深入阐明淫羊藿的药效物质基础及生物合成规律提供了科学依据。