基于IL-6/JAK2/STAT3信号通路研究岩白菜素对急性肝损伤大鼠的保护作用

蓝 颖，张可锋，连苑宇，陈俊杰，杨超越，王跃峰*，高 雅*

1广西壮族自治区人民医院，南宁 530021；2桂林医学院药学院，桂林 541000

急性肝损伤是一种在短期内由于药物中毒、免疫损伤、病毒感染等原因诱发的突发性肝功能异常疾病，目前治疗肝损伤的方法很多，西药疗效明显但药物不良反应较多且价格昂贵，肝移植治疗方法也存在供源缺乏、并发症多且病死率高等一系列问题[1]。课题组前期研究发现，中药在预防和治疗肝损伤中呈现独特的疗效，特别是中药提取物和中药单体化合物在抗氧化和调节炎症反应中作用显著，能有效降低CCl4诱导的急性肝损伤大鼠体内谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平和炎症因子的释放，提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性起到抗炎和抗氧化作用改善肝损伤，近年来也有茵栀黄注射液、水飞蓟素片等中成药开发上市来治疗肝损伤且临床疗效显著，但大多作用机制尚不明确[2-4]。岩白菜素是一种白色疏松针状结晶或结晶粉末状化合物，化学式C14H16O9，相对分子质量328.27，易溶于甲醇微溶于水或乙醇，该化合物存在于虎耳草科岩白菜全草及厚叶岩白菜和紫金牛科百两金的根茎叶中，是一种民间常用药，分布于我国四川西南部、湖南、云南北部及西藏南部和东部，又名为岩虎耳草素、矮茶素、岩白菜内脂、佛手配质等[5]。其具有良好的生物活性：如抗炎、抗癌、抗病毒、免疫调节、抗心律不齐等，临床上常用来治疗慢性支气管炎[6-9]。目前关于岩白菜素保肝的作用研究较少，因此，我们用CCl4诱导建立大鼠急性肝损伤模型，探究岩白菜素对急性肝损伤大鼠的保护作用，筛选新的保肝药物，探究其治疗急性肝损伤的作用机制来提高中药防治的靶向性，为药物的临床应用和开发提供依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体重180 ～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002，伦理委编号：GLMC201904008。

1.2 实验药物与试剂

岩白菜素(毕得医药，纯度≥98.65%，批次：RMC804)；分析纯CCl4(广东汕头市西陇化工厂)；水飞蓟素(美伦生物技术有限公司，批号：M1120A)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)、磷酸化Janus蛋白酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导和转录活化因子3(p-STAT3)、信号转导和转录活化因子3(STAT3)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化核转录因子-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白抗体(英国Abcam公司)；β-actin抗体购自傲锐东源生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所)；Super ECL Plus超敏发光液(北京普利莱基因科技有限公司)。

1.3 仪器

FRESCO 21高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司)；Olympus BX51显微镜(奥林巴斯)；Epoch 2HS酶标仪(Bio-Tek公司)；THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(太仓市实验设备厂)；电泳仪和转膜仪(Bio-Tek公司)；全自动化学发光图像分析检测系统(上海天能科技有限公司)；Eppendorf移液器(Eppendorf股份公司)；AUW220D半微量电子天平(岛津公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药

60只大鼠随机分为正常组、模型组、水飞蓟素(120 mg/kg)组、岩白菜素(20、40、80 mg/kg)低、中、高剂量组，每组10只。水飞蓟素组，岩白菜素低中高剂量组大鼠每天以10 mL/kg灌胃给药，正常组和模型组灌胃相应体积蒸馏水，每日1次，连续一周。末次给药2 h后，除正常组以外，其余各组大鼠均腹腔注射25% CCl4橄榄油溶液2 mL/kg，建立急性肝损伤模型。禁食不禁水，16 h后眼球取血，并收集肝脏。

2.2 肝组织病理学检测

使用4%多聚甲醛固定各组大鼠肝组织48 h，经过梯度乙醇脱水，石蜡包埋，将蜡块以4 μm厚度制作切片，进行HE染色，光学显微镜下观察大鼠肝组织的病理变化。

2.3 生化指标检测

将收集的血液在4 ℃静置3 h，放置于离心机离心15 min(4 ℃，4 500 rpm)，收集血清置于-20 ℃中冰箱保存备用。生化法检测血清中ALT、AST、ALB、MDA、GSH-Px、SOD活性或含量。

2.4 ELISA检测肝组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量

将肝组织置于研磨管中充分研磨，制备组织匀浆，取上清液后严格按照试剂盒说明书操作，检测并计算肝组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。

2.5 蛋白免疫印迹法实验

取肝组织约60 mg于研磨管，用移液枪吸取1 mL细胞裂解液加入研磨管后置于冰上充分研磨，待组织完全裂解后转移至EP管中，离心(4 ℃，14 000 rpm，10 min)，取上清液，采用BCA法测定蛋白含量。先配制浓度为10%的分离胶和浓度为5%的浓缩胶，加入蛋白样品后，调节电压为80 V进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，在冰浴条件下300 mA恒流转膜90 min，将蛋白转至PVDF膜，封闭2 h后，用TBST漂洗3次，加入Ⅰ抗置于4 ℃孵育过夜；TBST漂洗3次后加入Ⅱ抗，4 ℃孵育2 h，采用ECL法显色，全自动化学发光图像分析系统显影，分析蛋白灰度并计算目的蛋白相对表达量。

2.6 免疫组化实验

将4 μm组织切片于烘箱中37 ℃烘片过夜，二甲苯脱蜡10 min，脱蜡后浸入梯度浓度乙醇中水化，使用抗原修复液枸橼酸钠高压修复抗原4 min，修复后将切片冷却至室温，置于内源性过氧化物酶阻断剂10 min。PBS润洗3次后滴加Ⅰ抗于组织切片，37 ℃孵育1 h，PBS润洗3次后滴加Ⅱ抗孵育1 h，最后滴加DAB显色液孵育3～5 min，进行苏木素染色、盐酸酒精分化，流水反蓝后梯度乙醇脱水，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察IL-6表达情况。

2.7 统计学方法

3 实验结果

3.1 岩白菜素对CCl4致急性肝损伤大鼠肝组织病理形态的影响

观察HE染色及免疫组化结果，正常组(图1A)大鼠中央静脉周围未见细胞坏死，炎症细胞浸润等病理变化，且肝小叶结构完整，肝细胞呈放射状整齐排列。模型组(图1B)大鼠可见肝小叶结构严重破坏，汇管区及中央静脉周围出现大量肝细胞变性且坏死和炎症细胞浸润；与模型组相比，水飞蓟素(图1C)和岩白菜素组中(图1E)、高(图1F)剂量大鼠可见肝损伤程度明显降低，肝组织病变明显改善，岩白菜素高剂量组(图1F)改善状况尤为明显，其肝小叶和肝细胞结构清晰，炎症细胞浸润和细胞坏死情况改善。

3.2 岩白菜素对CCl4致急性肝损伤大鼠肝组织IL-6表达的影响

免疫组化结果显示，模型组(图2B)黄棕色沉积物聚集增多，显示IL-6表达明显升高，主要在受损肝细胞周围表达；与模型组相比，水飞蓟素(图2C)和岩白菜素组中(图2E)、高(图2F)剂量大鼠肝脏中IL-6表达明显降低，结果如图1和图2所示。

图1 肝组织HE染色病理检查图(200×)Fig.1 HE staining pathological examination of liver tissue (200×)注：A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：岩白菜素低剂量组；E：岩白菜素中剂量组；F：岩白菜素高剂量组；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Silymarin group;D:Bergenin low dose group;E:Bergenin middle lose group;F:Bergenin high dose group;The same below.

图2 肝组织IHC染色病理检查图(100×)Fig.2 IHC staining pathological examination of liver tissue (100×)

3.3 岩白菜素对大鼠血清中肝功能、氧化应激指标的影响

与正常组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST、MDA水平显著上升(P< 0.01)，ALB、SOD、GSH-Px含量或活性显著降低(P< 0.01)。与模型组相比，水飞蓟素组和岩白菜素中、高剂量组大鼠血清中ALT、AST、MDA水平显著降低(P< 0.01)，ALB含量增加，SOD、GSH-Px活性显著升高(P< 0.01)；岩白菜素低剂量组ALT、MDA水平降低(P< 0.05)，AST、ALB、SOD、GSH-Px活性或水平无统计学意义(见表1、表2)。

表1 岩白菜素对CCl4致急性肝损伤大鼠血清中ALT、AST和ALB的影响Table 1 Effects of bergenin on the activities of ALT,AST and ALB in serumof rats with acute liver injury induced by ± s,n = 10)

表2 岩白菜素对CCl4致急性肝损伤大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的影响Table 2 Effects of bergenin on the activities of MDA,SOD and GSH-Px in serum of ratswith acute liver injury induced by ± s,n = 10)

3.4 岩白菜素对大鼠肝组织中炎症因子含量的影响

与正常组相比，模型组肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显著升高(P< 0.01)。与模型组相比，水飞蓟素组和岩白菜素中、高剂量组大鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显著降低(P< 0.01)；岩白菜素低剂量组IL-6和IL-1β含量降低(P< 0.05)，TNF-α含量无统计学意义(见表3)。

表3 岩白菜素对CCl4致急性肝损伤大鼠肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影响Table 3 Effects of bergenin on the contents of TNF-α,IL-6 and IL-1β in liver tissueof rats with acute liver injury induced by by ± s,n = 10)

3.5 岩白菜素对IL-6/JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠肝组织中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P< 0.01)。与模型组相比，水飞蓟素组和岩白菜素中、高剂量组肝组织中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P< 0.01)；岩白菜素低剂量组p-JAK2蛋白表达水平降低(P< 0.05)，p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表达无统计学意义(见图3)。

图3 岩白菜素对CCl4致急性肝损伤大鼠肝组织中p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白表达的影响Fig.3 Effect of bergenin on p-JAK2,p-STAT3,p-NF-κB p65 protein expression in acute liver injury induced by CCl4

4 讨论与结论

研究表明，JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条信号转导通路，通过参与多种生长因子、细胞因子的信号转导来调节免疫和炎症反应[17]。IL-6是一种调节免疫和炎症反应的多功能细胞因子，IL-6/JAK2/STAT3信号通路的激活是IL-6与其靶细胞表面的受体sIL-6R识别结合形成复合物sIL-6R/IL-6，膜表面糖蛋白130(gp-130)被其活化后使得相关联的JAK2被激活，激活后的JAK2与下游效应因子信号转导和激活转录因子3(STAT3)结合发生磷酸化[18,19]。磷酸化的STAT3激活核转录因子NF-κB，NF-κB被激活转移到细胞核后，继而促进TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子释放，这些炎症因子表达过量时，又可正反馈作用于NF-κB，继而促进炎症反应，加重肝组织的损伤[20-22]。此外，IL-6/JAK2/STAT3通路的激活可促进B细胞分化为浆细胞，并刺激IL-6的自分泌，从而形成正前馈循环，也会导致炎症反应进一步扩大[23-25]。本研究结果显示，与正常组相比模型组IL-6及p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65表达显著增加，提示该炎症信号通路可能被激活；给予岩白菜素药物治疗后，血清中肝功能指标ALT、AST、MDA、SOD、GSH-Px趋向正常，IL-6、p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κB p65的表达不同程度降低，病理切片显示肝组织汇管区及中央静脉周围肝细胞变性坏死和炎症细胞浸润状况明显改善，免疫组化明显可见IL-6表达不同程度降低，以上提示岩白菜素可能通过干预IL-6的表达，从而抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路的激活减少炎症因子的释放，减少炎症和凋亡，从而有效地改善肝损伤。

综上所述，岩白菜素可有效减缓CCl4诱导的大鼠急性肝损伤，其机制可能与IL-6/JAK2/STAT信号通路介导的炎症反应和抗氧化有关，本研究结果可为临床采用岩白菜素治疗急性肝损伤提供新思路。