LRP5基因A1330V、Q89R位点多态性、突变与绝经后T2DM骨质疏松症的关系

何跃辉 陈狄 高谦 施平华 金辉 冯艳苹 尤丛蕾 汤莉娜

北京积水潭医院，北京 100035

低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5) 是一种定位于11q13.4染色体的细胞膜表面蛋白[1]，全长约136 kb，属低密度脂蛋白受体超家族的一员，共包含23个外显子[2-3]。目前LRP5 基因在人体中的作用尚未完全阐明，但多项针对小鼠的动物研究显示，LRP5基因在小鼠体内的作用是维持糖、脂代谢，并参与葡萄糖诱导的胰岛素分泌过程[4]。人与小鼠LRP5基因的同源性研究显示，其蛋白序列的同源性高达94 %[5]，由此推测LRP5 基因对人体的糖脂代谢有调节作用。近年来有研究在成骨细胞上发现LRP5基因表达，而检测破骨细胞则未发现LRP5基因表达[6]。因此LRP5基因对人类骨量及成骨细胞的作用成为近年来代谢性骨病研究的热点。2型糖尿病(type 2 diabetic，T2DM)是代谢性疾病之一[7]。骨质疏松症(osteoporosis，OP) 是一种全身性骨疾病，特点是骨密度下降，骨折风险增高。绝经后女性由于雌激素缺乏，是OP的高发人群。有研究扫描人类LRP5基因时发现，在7个序列中，A1330V和Q89R为预测替换LRP5蛋白上的氨基酸，A1330V、Q89R位点基因型的改变可改变氨基酸，可能会影响LRP5基因正常作用的发挥[8]。为此，本研究通过对T2DM伴OP组、T2DM组、OP组与健康对照组受试者LRP5基因A1330V、Q89R位点基因型分布特点、糖代谢骨代谢指标及T2DM伴OP患者不同基因型糖代谢骨代谢指标进行分析，旨在进一步探讨T2DM与OP的发病机制，为该病的预疗提供理论依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 一般资料

2018年10月至2020年10月我院门诊81例绝经后T2DM患者，根据是否伴OP分为T2DM伴OP组39例，年龄52～61岁；T2DM组42例，年龄51～60岁；单纯OP患者40例为OP组，年龄53～62岁；同期体检中心健康体检的绝经后女性40例为对照组，年龄52～60岁；各组年龄、绝经年限、体质量指数(BMI)差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组基线资料比较Table 1 Comparison of baseline data between each

1.2 纳入及排除标准

本研究经院医学伦理委员会批准。纳入标准：①绝经后女性；②T2DM组患者均符合1999年WHO推荐的T2DM诊断标准，OP组患者均符合1994年WHO推荐的OP诊断标准，T2DM伴OP组患者均符合上述两项诊断标准；③患者知情同意接受相关指标检测，知情同意研究方法，并签署知情同意书。排除标准：①合并甲亢等影响骨代谢指标的疾病患者；②严重的心、肝、肾疾病患者，消化道疾病可能影响钙、磷吸收患者；③合并恶性肿瘤患者；④服用降钙素、雌激素、维生素K等对糖代谢、骨代谢指标有影响药物的患者。

1.3 检测方法

1.3.1骨密度(BMD)检测方法：双能X线骨密度测量仪(美国GE公司)对受试者股骨颈、腰椎前后位、大转子Troeh区和非优势侧Ward三角区的BMD值进行检测。所有受试者的BMD检测均由同一人员操作以减少误差。

1.3.2LRP5基因DNA提取及PCR反应方法：DNA试剂盒(德国QIAGEN公司)；DralII限制酶(Bio Basic公司)；AvaⅡ限制酶(大连宝生物工程有限公司)；PCR试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)；酶反应产物纯化试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)。

所有受试者均抽取5 mL空腹静脉血置于2 %EDTA抗凝管中摇匀，离心后留取中层白细胞浓缩层，提取DNA。

设计引物序列，并经计算机检索，确保引物序列与非扩增区无同源性。A1330V位点引物序列组成：上游引物：5’-GCTGGGCTGTTGATGTITAGA-3’，下游引物：5’-AGAGGCAAGGTTTTCCCATAA-3’。Q89R位点引物序列组成：上游引物：5’-TCTGGGCATAGTGCTCCATC-3’，下游引物：5’-TTCCGGGATGTGCCATTGAG-3’。PCR反应条件如下：预变性94 ℃，5 min，变性94 ℃，30 s，退火59 ℃，45 s，延伸72 ℃，1 min，循环35次，72 ℃再延伸10 min。电泳后在紫外分析仪下显示被内切酶切断的DNA片断。

A1330V多态性DraⅢ酶片段：AA基因型(野生型)143 bp；AV基因型(杂合子)143 bp、119 bp、24 bp；VV基因型(突变型)119 bp、24 bp。

Q89R多态性 AvaⅡ酶片段： QQ基因型(野生型)436bp；QR基因型(杂合子)436bp、274 bp、162 bp；RR基因型(突变型)274 bp、162 bp。

由两人对结果进行判读，判读结果一致后得出结论。

1.3.3骨代谢指标检测：采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、血清骨碱性磷酸酶(BALP)。4 l～8l岁女性TRACP-5b 参考值范围为2.34～4.04 U/L。BALP参考值范围为12.5～22.4 μg/L。

1.3.4糖代谢指标检测：采用高压液相法在全自动糖化血红蛋白分析仪上检测糖化血红蛋白(HbAIC)，4 l～8l岁女性正常参考值范围为4.5 %～6.2 %；采用放射免疫分析法检测空腹胰岛素(FINS)，4 l～8l岁女性正常参考值范围为1.22～25.5 mol/L。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组骨密度、骨代谢、糖代谢指标比较

T2DM伴OP组HbAIC、FINS高于对照组，腰L2-4BMD、股骨颈BMD低于对照组；T2DM组HbAIC、FINS高于对照组；OP组腰L2-4BMD、股骨颈BMD低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组骨密度、骨代谢、糖代谢指标比较Table 2 Comparison of bone mineral density, bone metabolism, and glucose metabolism indicators between each

2.2 各组LRP5基因A1330V、Q89R位点基因型分布

T2DM伴OP组、T2DM组和OP组LRP5基因A1330V位点AA型、AV型、VV型分布与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。T2DM伴OP组、T2DM组和OP组LRP5基因Q89R位点基因型分布与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组LRP5基因A1330V、Q89R位点基因型分布[n(%)]Table 3 The genotype distribution of LRP5 gene A1330V and Q89R locus in each group[n(%)]

2.3 T2DM伴OP患者LRP5基因多态与骨代谢和糖代谢的关系

T2DM伴OP组LRP5基因A1330V位点AA型、AV型、VV型HbAIC、腰L2-4BMD、股骨颈BMD差异均有统计学意义(P<0.05)。AA型、AV型、VV型TRACP-5b、BALP、FINS比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 T2DM伴OP组LRP5基因A1330V位点AA型与VV型骨代谢与糖代谢指标比较Table 4 Comparison of bone metabolism and glucose metabolism indexes between AA and VV type at the A1330V site of LRP5 gene in T2DM with OP

3 讨论

T2DM与OP均是临床发病率较高的疾病，特别是绝经后女性是OP的高危人群。T2DM与OP的病因受环境和遗传等多因素影响，多种基因参与其中。本研究共纳入了161名绝经后女性，并根据疾病分为T2DM伴OP组、T2DM组、OP组和对照组，各组年龄、绝经年限、BMI差异均无统计学意义。但T2DM伴OP组、T2DM组HbAIC、FINS高于对照组；T2DM伴OP组、OP组腰L2-4BMD、股骨颈BMD均低于对照组，差异均有统计学意义。说明T2DM伴OP患者较之健康者存在明显的糖代谢和骨代谢异常。

目前研究发现，细胞因子基因、性激素受体基因等调节钙、磷代谢的激素及其受体基因在T2DM与OP的发生与进展中起着重要作用[9]。近年来，LRP5基因引起了临床的广泛关注，Nonhem印迹分析显示人类LRP5基因在心、肝、肺、骨骼、小肠、脑及骨骼等多个器官组织中均有表达[10]。基因多态性是指在某个生物群体中，经常或同时存在两种或两种以上不连续的变异型或基因型。王永兰等[11]研究了LRP5基因多态性与绝经后2型糖尿病骨质疏松症的关系，认为LRP5基因多态性与患者BMI、胰岛素水平增高有关，认为LRP5基因多态性可能是绝经后骨质疏松症的易感基因。但王永兰等未针对LRP5基因A1330V、Q89R位点多态性、突变对骨密度与糖代谢的关系进行研究，所以不明确具体的位点。本研究发现本地绝经后女性LRP5基因在A1330V、Q89R位点呈多态性，其中T2DM伴OP组LRP5基因A1330V位点AA型、AV型、VV型构成分别为28.21 %、28.21 %、46.15 %；T2DM组为45.24 %、38.10 %、11.90 %；OP组分别为55.00 %、15.00 %、30.00 %；对照组分别为65.00 %、32.50 %、2.50 %，T2DM伴OP组、T2DM组和OP组AV型、VV型均高于对照组，差异有统计学意义。提示LRP5基因A1330V位点多态性及突变与糖代谢、骨代谢有关，可能是T2DM、T2DM伴OP、OP患者LRP5基因多态性及突变致单核苷酸突变，其受体信号传导系统随之改变，从而影响到LRP5基因与配体的结合而导致了T2DM、OP的发生。LRP5基因Q89R多态性在白人及其他种族中出现的频率较低，但在亚洲人群中出现的频率较多。本研究中T2DM伴OP组、T2DM组、OP组和对照组均检出了QQ型、QR型，未检出RR型，可能与样本量较少有关。T2DM伴OP组、T2DM组、OP组LRP5基因Q89R位点基因型分布与对照组比较差异无统计学意义。可能LRP5基因Q89R位点多态性与糖代谢、骨代谢无关。

Johnston[12]认为，人体骨量的差别是由环境和遗传因素决定的，其中前者占20 %，后者占80 %。同时有研究通过对两卵双生和一卵双生双胞胎骨量的研究发现，骨量的获得是通过基因调节的[13]。目前已知调控骨密度和骨代谢的基因包括三类：第一类是骨钙素BGP基因、钙感受性受体CASR基因等影响骨量获得的基因；第二类是降钙素受体CTR基因、ER基因等影响骨量丢失的基因；第三类是转录生长因子TGF-β1基因、VDR基因等对骨量获得和丢失均可能有影响的基因[14]。LRP5基因可作为Wnt共受体参与Wnt信号传导，其蛋白触发的主要信号传导途径为Wnt-β粘连素途径，又称规范化Wnt信号途径。近年来，一项针对亚洲人群LRP5基因A1330V多态性的研究显示，A1330V位点与骨密度相关[15]。但也有研究发现LRP5基因A1330V位点多态性及突变与骨密度无相关性[16]。本研究结果显示，T2DM伴OP组LRP5基因A1330V位点AA型、AV型、VV型HbAIC、腰L2-4BMD、股骨颈BMD差异均有统计学意义。说明本地人群中LRP5基因A1330V位点多态性及突然对绝经后女性T2DM和OP的发生有影响。

综上所述，LRP5基因可能是绝经后女性T2DM和OP的易感基因，A1330V位点多态性及突变可能对绝经后女性T2DM和OP的发生有影响，Q89R位点多态性及突变与糖代谢、骨代谢无关。同时T2DM与OP两种疾病均为多因素疾病，一种或两种基因的调节作用有限，与之相关的候选基因还有很多，应通过各项生物分子学的手段对候选基因的作用机制进行分析，为T2DM与OP的防治提供指导。