黄孢原毛平革菌降解光氧化褐煤的过程特性

李建涛，刘向荣，杨 杰，庄肃凯

(1.商洛学院化学工程与现代材料学院，陕西 商洛 726000；2.西安科技大学化学与化工学院， 陕西 西安 710054；3.陕西省尾矿综合利用重点实验室，陕西 商洛 726000)

煤炭是我国最主要的能源物质，在能源结构中长期占据主导地位，同时也是重要的化工原料来源。随着国家可持续发展战略的提出，节能和环保已成为社会和经济发展的目标和重要衡量指标。因此，煤炭，特别是低阶煤的清洁高效利用对于我国社会和经济的健康良性发展至关重要。煤的微生物降解是低阶煤清洁高效利用的前沿技术，其主要是利用某些真菌、细菌或放线菌在一定条件下使煤降解为可溶于水的物质、烃类气体或其它化学品[1-3]，这些降解物可以作为清洁燃料、化工原料、工业添加剂、植物生长促进剂等。煤的微生物降解在室温、常压下就能进行，具有设备简单、条件温和、能耗低、产物利用价值高等优点[4-6]。然而，低阶煤的微生物降解技术还处于实验室研究阶段，离工业化还有一定距离，亟待加大力度研究。

黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是目前报道较多的煤降解真菌菌株之一，其在生长过程中能够产生多种对木质素类物质有极强降解能力的酶，而煤中含有类木质素结构，故能被黄孢原毛平革菌降解[7-8]。作者利用驯化的黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤，通过测定分析降解过程中某些特定参数揭示光氧化煤降解特性。

1 实验

1.1 煤样及预处理

煤样为内蒙胜利褐煤(SLH)。

将煤样破碎至20 mm以下，60 ℃烘3 h，研磨，筛分，选取粒度范围为0.075～0.150 mm的煤样。利用旋转床光化学反应器[9]对煤样进行光氧化预处理[10]，得到光氧化内蒙胜利褐煤(GSLH)。光氧化预处理条件如下：煤样20 g，煤样粒度0.075～0.150 mm，氧气流量200 mL·min-1，通氧时间40 min，紫外光照射功率150 W，马达转速120 r·min-1，氧化反应时间42 h。

1.2 菌株与培养基

黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号CGMCC 3.7212。

改良马丁液体培养基：蛋白胨5 g，酵母浸粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.2～6.6。其固体培养基加琼脂15 g。

1.3 降解过程的微量热实验

采用法国Setaram C80型微量热计测定黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的微量热曲线。实验前先对操作间及实验器具进行紫外光照射灭菌30 min，利用空调控制室温为30 ℃。首先，在参比池下层加入26 mg煤样，上层加入2 mL改良马丁液体培养基；在样品池下层加入26 mg煤样，上层加入2 mL改良马丁液体培养基，并接种180 μL菌液(孢子浓度为2.3×106个·mL-1)[11]。然后，装配好连动杆，将反应池和参比池放入微量热计主体内，设定温度为303.15 K，待温度达到平衡后，按下连动杆捅破塑料隔膜，并同时转动连动杆数圈使煤样与培养基、煤样与菌液混合；当温度达到平衡后，点击开始，微量热计记录热量变化，得到热量变化与时间的微量热曲线。由微量热曲线可以得到黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的重要热力学信息[12-14]。

1.4 光氧化内蒙胜利褐煤的降解实验

取500 mL烧瓶若干，分别加入200 mL改良马丁液体培养基，按9%接种量接种黄孢原毛平革菌种子液(孢子浓度为2.3×106个·mL-1)；置于恒温培养箱中，30 ℃、210 r·min-1培养2 d；再按0.013 g·mL-1(以液体培养基计)加入光氧化内蒙胜利褐煤，继续降解17.8 d[12]。同法进行不加煤的黄孢原毛平革菌纯培养实验和不接种菌的培养基溶煤实验。在培养0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h取样过滤，分别测定降解液和纯培养液的pH值、表面张力、450 nm处吸光度A450值以及培养基溶煤液的A450值。

pH值的测定：将降解液/纯培养液于10 000 r·min-1离心15 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，采用PHS-3C型酸度计测定滤液pH值。

表面张力的测定：采用德国KRÜSS公司的K100型表面张力仪测定[15-16]。

A450值的测定：以去离子水为参比，采用TU-1900型紫外可见分光光度计测定。

2 结果与讨论

2.1 降解过程的微量热研究[17-18]

黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的微量热曲线如图1所示。

由图1可知，黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的微量热曲线大致可分为4个阶段：迟缓期(AB段)、指数生长期(BC段)、稳定期(CD段)和衰亡期(DE段)，降解过程中释放的总热量为186.73 kJ·g-1，降解时间为15.1 d。

图1 黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的微量热曲线Fig.1 Microcalorimetric curve of GSLH degraded by Phanerochaete chrysosporium

黄孢原毛平革菌在指数生长期(BC段)内，菌数量呈指数增加，可用式(1)表示：

nt=n0ek(t-t0)

(1)

式中：n0为指数生长期开始时刻(t0)的菌数量；nt为指数生长期内t时刻的菌数量；k为指数生长期生长速率常数，min-1。

令每个菌在生长过程中单位时间内放出的热量为P(即热功率)，则有式(2)、(3):

Pnt=Pn0ek(t-t0)

(2)

Pt=P0ek(t-t0)

(3)

式(3)中：Pt为t时刻的总热功率；P0为t0时刻的总热功率。对其两边取对数可得式(4)：

lnPt=lnP0+k(t-t0)

(4)

以lnPt对t作图，并进行一次拟合(图2)，求得指数生长期生长速率常数k=4.0408×10-4min-1。

图2 lnPt-t关系曲线及拟合曲线Fig.2 lnPt-t curve and fitting curve

2.2 降解过程的pH值变化

黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的降解液及纯培养液的pH值随培养时间的变化曲线如图3所示。

图3 降解液和纯培养液的pH值随培养时间的变化曲线Fig.3 Change curves of pH values of degradation solution and pure culture solution with culture time

由图3可知，黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的降解液与纯培养液的pH值变化趋势基本一致，均在指数生长期内持续快速升高，在衰亡期内逐渐降低；培养时间相同时，纯培养液的pH值高于降解液的。这是因为，黄孢原毛平革菌在生长过程中产生了促使pH值升高的碱性物质(菌体利用氮营养源生长，代谢产生的氨、铵离子以及有机胺类等物质)；而在降解煤的过程中因为黄孢原毛平革菌代谢产生的碱性物质会与煤中的酸性基团反应，从而消耗了碱性物质，导致降解液pH值降低，这也印证了微生物降解煤的碱作用机理。

2.3 降解过程的表面张力变化

黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的降解液及纯培养液的表面张力随培养时间的变化曲线如图4所示。

图4 降解液和纯培养液的表面张力随培养时间的变化曲线Fig.4 Change curves of surface tension of degradation solution and pure culture solution with culture time

由图4可知，黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的降解液与纯培养液的表面张力变化趋势基本一致，随培养时间的延长均呈减弱趋势，表明黄孢原毛平革菌在生长代谢过程中产生了表面活性剂，导致生长环境液体表面张力减弱，这也符合微生物降解煤的表面活性剂机理。培养时间相同时，降解液的表面张力均强于纯培养液的。这是因为，在黄孢原毛平革菌降解煤的过程中，煤有机分子吸附黄孢原毛平革菌代谢产生的表面活性剂而“自溶”于液体中(表面活性剂降解煤机理)，导致溶液中表面活性剂浓度降低，液体表面张力增强。

2.4 降解过程的A450值变化

黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的降解液、纯培养液、培养基溶煤液的A450值随培养时间的变化如图5所示。

图5 降解液、纯培养液和培养基溶煤液的A450值随培养时间的变化曲线Fig.5 Change curves of A450 values of degradation solution,pure culture solution,and medium-coal solution with culture time

由图5可知，黄孢原毛平革菌纯培养液的A450值很小且随着培养时间的延长变化不大；培养基溶煤液的A450值亦很小，但随着培养时间的延长稍有增大；而黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的降解液的A450值在迟缓期就有增大趋势，在指数生长期迅速增大，在稳定期持续增大，在衰亡期略微减小。充分证实黄孢原毛平革菌的作用使得光氧化内蒙胜利褐煤发生了降解。

3 结论

黄孢原毛平革菌降解光氧化内蒙胜利褐煤的微量热曲线可分为4个阶段：迟缓期、指数生长期、稳定期和衰亡期，与黄孢原毛平革菌的生长曲线相符；降解过程释放的总热量为186.73 kJ·g-1，降解时间为15.1 d，指数生长期生长速率常数k为4.040 8×10-4min-1。黄孢原毛平革菌在生长代谢过程中产生了碱性物质和表面活性剂，与纯培养液相比，降解液pH值降低、表面张力增强；黄孢原毛平革菌纯培养液和培养基溶煤液的A450值均很小，充分证实黄孢原毛平革菌的作用使得光氧化内蒙胜利褐煤发生了降解。