吉富罗非鱼肌肉中土臭素含量影响因素分析

2021-10-08东新旭范立民裘丽萍孟顺龙陈家长

淡水渔业 2021年5期

东新旭，范立民，宋超，郑尧，裘丽萍，孟顺龙，陈家长,

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081)

罗非鱼又称为“非洲鲫鱼”，原产自非洲的内陆水域，具有适应范围广、生长繁殖速度快和抗逆性强等特性[1]，是联合国粮农组织推荐的优良品种之一[2]。因其具有较好的生长优势，在我国南方地区被大规模养殖，已成为我国重要的水产养殖品种[3]。但是在罗非鱼的养殖过程中，养殖产品常常带有土腥异味，尤其是在富营养化的淡水养殖池塘中。异味通常是土臭素(GSM)和二甲基异莰醇(2-MIB)[4]引起，在水中的嗅觉阈值浓度为1～10 ng/L，在鱼肉中的嗅觉阈值为0.9 μg/L[5]。带有土腥异味的罗非鱼养殖产品，不仅严重影响了其食用价值，而且也降低了其商品价值，甚至带有土腥异味的养殖产品对人体造成损害，食用的安全性受到质疑[6]。

已有研究表明，在水产养殖过程中，大多数的土腥异味问题是由藻类所造成的，特别是在富营养化的淡水养殖池塘中[7]。对于水体中GSM的藻类来源，多认为蓝藻是异味源，报道的产土腥味的蓝藻有微囊藻、束丝藻、颤藻、鱼腥藻、鞘丝藻等属的种类[8-9]，绿藻门中的栅藻[10]、金藻门中的黄群藻[11]也能产生土腥异味物质，还有淡水鱼池中直连藻、小环藻也可能产生土腥异味物质[12]。主要是由于水体土腥异味物质的来源较为复杂多变，环境因子和藻株特异性会对土腥异味的产生造成影响[13]，因此存在着许多的争议。而鱼肉中GSM的产生多被认为是皮肤、鳃等器官通过渗透作用，从水中直接进入鱼体内的。目前，水体GSM的来源研究取得了一定的进展，而对于鱼类肌肉中GSM来源研究鲜有报道，本研究通过吉富罗非鱼在养殖中设置不同饵料投喂率，探究在养殖生产时吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)肌肉中GSM含量的影响因素，以期为改善吉富罗非鱼养殖品质提供重要参考。

1 实验方法和材料

1.1 试验用鱼及饲养方法

实验开始时间为2020年7月27号，在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心开展，试验周期为50 d。试验设置5个组，每组各3个平行，每个组分别投喂鱼体重的1%、2%、4%、6%、8%的天邦牌淡水鱼膨化饲料。养殖前，每个容积为1 000 L圆形养殖PVC桶中均放入2 kg底泥(采自宜兴吉富罗非鱼养殖池塘)提供土著微生物源。养殖时，每个养殖桶放养30尾规格为(16±2) g的吉富罗非鱼(采自宜兴吉富罗非鱼养殖基地)。整个养殖周期各组均不换水，全程使用增氧泵增氧，不用药，每天的8:00和14:00各投喂一次。

1.2 养殖水体和吉富罗非鱼肌肉中GSM测定方法

SPME-GC-MS固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法检测水中GSM，建立标准曲线，相关系数r为0.998 2，平均回收率范围为45.28%～49.92%。测定方法为10 mL容量瓶加入2 g NaCl，再加入水样定容到10 mL，在加热板上控制温度60～70 ℃水浴固相萃取GSM，30 min后，取下固相萃取棒放入到GC-MS上测定GSM含量。分别在8月3日、8月17日、8月24日、9月2日、9月14日采集水样测定水中GSM含量。

在养殖结束时(9月14日)，捕捞各个组的吉富罗非鱼，规格见表1，取吉富罗非鱼鱼肉置于-20 ℃冰箱中冷冻保存。用微波加热蒸馏的方法[14]提取GSM，准确称取10 g吉富罗非鱼鱼肉，置于500 mL蒸馏瓶中，密封，放入微波蒸馏装置，装置参考韩萃等[15]所用装置图，反应瓶中通入流速70 mL/min的氮气，微波功率调节为350 W，加热时间6 min，通过冷凝装置对馏分降温，收集瓶置于冰水浴中收集馏分，收集完后密封置于4 ℃冰箱中保存。收集完的样品检测采用SPME-GC-MS测定方法,与水体中GSM检测方法相同。

表1 养殖吉富罗非鱼系统不同饵料投喂率吉富罗非鱼的生长规格

1.3 水质指标测定、浮游植物计数及相关性研究

水样采集后的总氮、总磷、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐等水质指标按照文献[16]所提供的方法进行测定。

在与1.2描述的相同时间段，采集水面以下30 cm处的浮游植物样品，浮游植物样品采集方法参照文献[11]。浮游植物鉴定方法参照文献[17-18]。

水质指标、氮磷比与浮游植物的RDA分析通过Canoco5，水体中GSM和肌肉中的相关性，水质指标、氮磷比、浮游植物与水体中GSM含量相关性，浮游藻类与肌肉中的相关性通过GraphPad Prism 8中的Results-New Analysis-Multiple variable analyses-Correlation matrix进行分析，P>0.05，差异不显著，P<0.05，差异显著。

1.4 数据统计和分析

采用Excel 2019和SPSS 22软件进行数据处理，Canoco5、GraphPad Prism 8进行绘图。

2 结果

2.1 养殖吉富罗非鱼肌肉与水中GSM含量

2.1.1 吉富罗非鱼养殖水中GSM含量

如图1所示，养殖期间，水中平均GSM含量在17.79～42.47 ng/L范围内，随着饵料投喂率的逐渐增加，1%～6%水体中GSM呈现逐渐升高的趋势，6%饵料投喂率水体中GSM含量显著高于1%饵料投喂率。

图1 养殖吉富罗非鱼养殖系统水体中GSM含量变化分析

2.1.2 养殖吉富罗非鱼肌肉中GSM含量

从图2中可以看出，经过SPSS分析虽然不同饵料投喂率养殖的吉富罗非鱼肌肉中GSM含量差异不显著，但是2%～6%饵料投喂率的吉富罗非鱼肌肉中GSM含量相比于其他组含量较低，而8%饵料投喂率的吉富罗非鱼肌肉中GSM含量较高，平均GSM可达到1 062.72 ng/kg，吉富罗非鱼肌肉中GSM平均含量最低的组为6%饵料投喂率，平均GSM含量为409.77 ng/kg，1%饵料投喂率的吉富罗非鱼肌肉中GSM含量较高，平均GSM可达到813.93 ng/kg,。各饵料投喂率组吉富罗非鱼肌肉中平均GSM含量由大到小排序为：8%饵料投喂率>1%饵料投喂率>4%饵料投喂率>2%饵料投喂率>6%饵料投喂率。

图2 不同饵料投喂率吉富罗非鱼鱼肉中GSM含量的变化

2.1.3 养殖吉富罗非鱼系统水体中GSM含量与肌肉中GSM含量相关性分析

经过相关性分析发现，吉富罗非鱼养殖系统水体中GSM含量与肌肉中GSM含量相关性不大(r=-0.330，P=0.229)。

2.2 养殖吉富罗非鱼系统水质指标含量和浮游植物丰度变化

2.2.1 水质指标变化

如图3所示，水质指标氨氮含量、硝酸盐含量和亚硝酸盐含量随着饵料投喂率的增加都呈现一个逐渐增加的趋势，氨氮含量6%和8%饵料投喂率显著高于1%和2%饵料投喂率，与4%饵料投喂率差异不显著；硝酸盐氮含量8%饵料投喂率显著高于其他各组；亚硝酸盐含量6%和8%饵料投喂率显著高于1%和2%饵料投喂率；4%饵料投喂率氮磷比最高，平均氮磷比可达8.03，并且显著高于1%和2%饵料投喂率氮磷比，6%和8%饵料投喂率平均氮磷比分别达到7.53、7.83，与4%饵料投喂率氮磷比差异不显著。不同饵料投喂率对吉富罗非鱼养殖系统水质因子会产生明显的影响。

图3 不同饵料投喂率水体中平均硝酸盐、氨氮、亚硝酸盐含量和氮磷比的变化

2.2.2 养殖水体中浮游植物平均丰度的变化

养殖吉富罗非鱼系统水样共进行了5次采集，共检出绿藻、硅藻、蓝藻、甲藻、隐藻、裸藻6门36属，其中绿藻门种类最多，共22属，占浮游植物总量的61.11%；其次是硅藻门和蓝藻门，均为5属，共占浮游植物总量的27.78%；之后依次为甲藻门、隐藻门、裸藻门，为2、1、1属，占浮游植物总量的5.56%、2.78%、2.78%。栅藻、蓝藻、硅藻、甲藻占有优势。养殖吉富罗非鱼系统中不同饵料投喂率水体中浮游植物的各个门优势属组成见表2，浮游植物优势属共20个，1%、6%、8%组中最多，4%组中最少，栅藻属占浮游植物总丰度的24.37%,微囊藻属占浮游植物总丰度的6.78%。

表2 养殖吉富罗非鱼系统中浮游植物各个门优势属平均丰度

2.3 水质指标、浮游植物和水中GSM及浮游植物与肌肉中GSM相关性研究

2.3.1 水质指标、氮磷比、浮游植物与水体中GSM含量相关性分析

表3相关性分析表明水体中GSM含量主要与氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氮磷比呈现相关性，但相关性不显著。

表3 水质指标、氮磷比与水体中GSM含量相关性分析

通过对养殖吉富罗非鱼系统水质指标与优势浮游植物冗余(RDA)分析(图4)可知，氨氮、硝态氮、亚硝态氮、氮磷比对微囊藻属、栅藻属、小环藻属都呈现正相关作用。

图4 养殖吉富罗非鱼系统水质指标与优势浮游植物RDA分析

采用Pearson相关分析法对水体中平均GSM含量与浮游植物群落平均丰度进行相关性分析(见表4)，养殖吉富罗非鱼系统中GSM含量与栅藻属、小环藻属和微囊藻属具有显著的正相关，与舟形藻属呈显著负相关。

表4 养殖吉富罗非鱼系统中浮游植物与水中GSM含量Pearson相关性分析

2.3.2 浮游植物与肌肉中GSM含量相关性分析

通过养殖吉富罗非鱼系统中浮游植物群落与肌肉中GSM含量Pearson相关性分析(见表5)，可以看出养殖吉富罗非鱼肌肉中GSM含量与硅藻门中直链藻属(颗粒直链藻)呈显著正相关，与蓝藻门中颤藻属、绿藻门中盘星藻属呈现较强的相关性，但是不显著，除此之外，与其他藻属的相关性较差。

表5 养殖吉富罗非鱼系统浮游植物平均丰度与肌肉中GSM含量Pearson相关性

3 讨论

3.1 吉富罗非鱼养殖系统水中GSM含量及影响因素分析

作为淡水养殖池塘中主要的土腥异味物质之一[13]，GSM广泛存在于包括斑点叉尾养殖池塘[20]和本文研究的吉富罗非鱼养殖池塘在内的淡水养殖池塘环境中。在斑点叉尾养殖池塘中的浓度大于0.3 ng/L[19]，远低于本实验各组水体中GSM的含量(17.79～42.47 ng/L)。因此，不同养殖品种淡水养殖环境水体中GSM的含量具有较大的差异性。

已有研究表明，水质状况会影响水环境中异味物质的产生及分布[20-21]。本试验研究也表明，吉富罗非鱼养殖系统中水体氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氮磷比等指标与水中的GSM含量具有一定相关性。我们知道，水中氮、磷等物质会为水中藻类生长提供营养，而蓝藻是产生GSM的主要生物类别之一，这可能是水质状况与水中GSM有相关性的根本原因。就本研究中所重点提及的藻类、尤其是蓝藻来讲，水体中氮、磷营养盐是微藻繁殖所需的生物学基础，也是浮游藻类繁殖的限制性因素[22]，蓝藻的丰度与环境中的氮磷比具有相关性，当氮磷比<29时，环境中的优势藻类更倾向于蓝藻[23]。在本研究中的氮磷比的范围为4.19～9.64之间，养殖水环境有利于蓝藻的生长。RDA分析结果表明氨氮、硝态氮、亚硝态氮、氮磷比对蓝藻门中的微囊藻属的相对丰度呈现正相关作用，而相关分析也表明微囊藻属的相对丰度也与水中GSM呈显著正相关关系。因此，水质状况与水中GSM有关的根本原因可能是水质状况对水中能够产生GSM的生物种类、例如蓝藻的生长产生了影响。除此以外，本研究还表明，吉富罗非鱼养殖系统中水体GSM含量还与硅藻门中的小环藻属以及和绿藻门中的栅藻属呈现显著的正相关关系，关于这样的结果，先前的研究也有报道，包括绿藻门中栅藻以及硅藻门中的小环藻也可能产生土腥异味物质[13]。综合分析来看，本实验中，通过不同的饵料投喂率向养殖吉富罗非鱼系统中输入不同量的营养盐，改变了水体中的水质状况，干扰了养殖水体中浮游植物群落结构，影响了水中可能产GSM浮游植物藻类微囊藻、栅藻、小环藻等藻类的丰度，进而对水体中GSM的含量产生作用。

3.2 池塘养殖吉富罗非鱼肌肉中GSM含量及影响因素

本研究中，罗非鱼肌肉中平均GSM含量范围为409.77～1 062.72 ng/kg，而人类对食品中GSM的感官阀值为700 ng/kg，因此，本研究中的部分罗非鱼肌肉样品由于GSM含量较高造成的土腥味已经可以对产品口味造成影响。具体是1%和8%饵料投喂率造成了对应组别GSM影响了罗非鱼产品的口感。以往的研究表明鱼肉中GSM含量会受到饲料磷含量、鱼体脂肪含量、鱼规格大小的影响[24-26]。在本研究中，8%饵料投喂率组相比于其他组由于投喂的饵料较多，吉富罗非鱼体重较重，规格也大，肌肉中GSM的含量较高，因此，8%饵料投喂率造成的罗非鱼肌肉中GSM含量较高可能与罗非鱼规格较大有关。而在8%饵料投喂率组水体中GSM含量却不是很高，表明罗非鱼肌肉中GSM含量和水中的含量没有相关关系，即水中的GSM通过鳃部毛细血管及皮肤进入血液循环可能不是吉富罗非鱼肌肉中GSM上升的主要原因。1%饵料投喂率吉富罗非鱼肌肉中也表现出的GSM较高含量，而对应的水体中的GSM含量在各组中也较低，首先进一步说明水体中GSM和吉富罗非鱼肌肉中GSM可能存在直接的相关关系。其次，1%饵料投喂率是较低的，吉富罗非鱼基本上处于饥饿的状态，对于水中包括藻类在内的有机颗粒的摄食强度可能会显著高于较高的饵料投喂率组，因此含GSM藻类及微生物的大量代偿性摄入，可能是造成1%饵料投喂率组吉富罗非鱼肌肉中GSM较高的主要原因。

然而，对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，虹鳟体内的GSM含量与鳃和皮肤对GSM的吸收有关[27]。众所周知，虹鳟为肉食性鱼类，这就决定了通过直接摄食水中的产GSM藻类和其他微生物的方式，基本不会成为其身体中GSM含量上升的主要原因。而本研究中的吉富罗非鱼为杂食性鱼类，其对水中产GSM藻类和其他微生物的直接摄入就会成为罗非鱼肌肉中GSM上升的直接原因。综上，本实验研究中吉富罗非鱼肌肉中的GSM含量可能是通过吉富罗非鱼摄食包括颗粒直链藻在内的水中产GSM微藻及细菌造成的，进而被胃肠道的消化吸收富集于鱼肉中。因此，在养殖能够摄食藻类的杂食性鱼类时，要求养殖水体中水体富营养化程度要低，否则容易导致藻类繁殖[28]，养殖鱼类摄食可能含有GSM藻类后[29-30]，会影响产品品质。另外，饵料投喂率要合适，基本原则是不要使包括罗非鱼在内的杂食性鱼类饵料摄入不足而代偿性提高水中微藻及微生物摄入强度，也不能使水体富营养化程度过高，使得水体微藻及微生物丰度显著上升。目前对于养殖水产品中土腥异味物质的来源还没有完全确认，进一步的研究可以借助C同位素标记的方法，追溯其产源。另外，本研究主要从藻类角度分析对土腥异味物质的影响，以前研究表明放线菌也可产生土腥异味物质[31]，本研究缺点和不足是没有对产GSM微生物等菌群进行分析，但仍可说明一定的问题。