太岁中真菌菌群结构及分离菌株的DNA验证

王朝江, 王世清, 高春燕, 李 慧, 夏伟伟

(河北省农林科学院经济作物研究所,河北 石家庄 050051)

自1992年首例太岁在陕西省周至县渭河被发现以来[1]，其分类属性就成为科学热点和社会关注点.黄建新等[1]将首例太岁鉴定为“大型粘菌复合体”；但在2010年又进行了自我否定[2]，原因是其后续研究发现太岁主体物质为聚乙烯醇，同时含有14.48%多糖，以及细菌、霉菌、酵母和粘菌，认为化工产品与微生物及其代谢产物共存的矛盾，只有从生物代谢与合成的角度才能得到最佳解释[2].2018年赵雅秋等[3]提出的“脱模物造假说”，无视太岁形态各异、外具褶皱、内多有纤维状纹理的特征，推定其为建筑胶遗留，但并未提供相应发现地证据；2020年Li et al[4]提出的“古老有机物说”，一方面自陷合成聚乙烯醇原因不明的困惑，另一方面，出现了太岁所藏地层在4万年前尚未形成的矛盾[5-6].另外，这2种假说也无法解释太岁中细菌分布极不均衡的现象[7-8].因此，太岁生物成因的可能性仍然最大，有待进一步探索.揭秘太岁属性的关键是能否从太岁中分离到具有合成“聚乙烯醇”类物质能力的菌种，这依赖于对太岁各类内含菌的逐一排查.

太岁中存在真菌已被多次证实：首例太岁中分离到枝顶孢霉属(Acremonium)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)等种类[9]；其他太岁中分离到假丝酵母(Candidasp.)、粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)[10]、卵圆假散囊菌(Pseudeurotiumovale)[11]、白色侧齿霉菌(Engyodontiumalbum)和埃及枝顶孢霉(Acremoniumegyptiacum)[4]等.然而，采用传统培养方法分离菌类，容易受培养基、培养难易度等因素影响，难以获得全部真菌，也无法知晓分离菌在整个菌群结构中的地位，且操作污染的干扰常使人怀疑其源自太岁的真实性.高通量测序技术具有通量高、速度快、准确度高以及运行成本低等特点，能够快速测知菌群结构，但其正确性易受DNA提取方法影响[8].目前，只有Li et al[4]采用该技术研究了7个太岁中的真菌，获知的优势属为拟青霉属(Paecilomyces)，同时分离到了腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)，但作者认为其均是来自环境而非太岁.该研究用常规方法提取DNA，存在太岁组织未彻底破碎、所含大量多羟基类物质未去除的问题，导致结果不可信[7].所以，有关太岁真菌菌群结构仍有待研究.

鉴于此，本研究采用高通量测序技术分析太岁中真菌菌群结构，并对分离菌进行DNA验证，以期为太岁生物成因的揭秘提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试太岁 红褐色、具尖圆柱体状太岁，发现于河南省三门峡市黄河岸边，浸水保存状态下触感如硬橡皮，内部组织致密、褐至浅红色，2007年底由作者收藏.

1.1.2 试剂及培养基 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，溶菌酶(北京索莱宝科技有限公司)，Transgen 2×Taq master Mix(北京全式金生物技术有限公司)，DNA检测试剂盒(Qubit 3.0，Life, America).真菌分离纯化培养基为高氏1号培养基[12].

1.1.3 主要仪器与设备 台式离心机(H1850，湘仪)，电泳仪(DYY-6C型，北京六一)，PCR仪(T100，BIO-RAD)，Miseq高通量测序平台(2×300，Illumina，美国)，光学显微镜(Nikon 80i，日本).

1.2 方法

1.2.1 取样及DNA提取 用于提取DNA的外层(SFO)组织样品取自没有红褐色分泌物质和杂物黏附的部位，切取深度0.5 cm；内层(SFI)组织样品取自表皮下2～3 cm处.每层在2个位置取样，分别编号.每份样品称取0.2 g，切成厚度小于1 mm的碎屑.分离真菌从内层组织取样.取样按无菌操作规程进行.

用CTAB法[13]提取DNA.提取前增加了热水溶解和0.22针头滤膜(Milex，美国)过滤溶解液处理，用富集菌体的滤膜提取[8].提取时用玻璃杵研烂滤膜.分离真菌DNA用平皿纯培养的菌丝体提取.

1.2.2 高通量测序及菌群分析 太岁样品DNA的高通量测序由生工生物工程(上海)有限公司完成.测序前经两轮扩增建库：第1轮引物为融合有Illumina Miseq测序平台的真菌rDNA引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC).PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 45 ℃ 20 s, 65 ℃ 30 s，5次循环；94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s，20次循环；72 ℃ 5 min.第2轮扩增引入Illumina桥式引物，产物经Qubit3.0 DNA试剂盒定量后，等量混合测序.

测序得到原始序列后，以标签序列(barcode)区分不同样品，经Cutadapt软件拼接、Prinseq[14]软件质控、Uchime软件过滤嵌合体、Usearch[15]软件去除非特异性扩增序列后得到优质序列；优质序列以97%相似水平划分OTU(operational taxonomic units).用RDP classifier算法[16]将OTU进行门、纲、目、属等水平的分类注释.

用香农(Shannon)指数、Chao1指数评估样品中真菌的α多样性和相对丰度；用覆盖率(coverage)指数评价测序数据量的真实合理性；用韦恩(Venn)图软件统计OTU在样品中的分布情况.将样品间共有、具高占比OTU支撑，且相对丰度高的菌群确定为优势菌群[8].

1.2.3 真菌分离及形态观察 取样切成碎屑，加水振荡15 min，制成浓度为50 mg·mL-1的太岁组织浸提液；每皿涂0.1 mL，20～25 ℃暗室培养10 d.

选择在不同皿上出现频次多且非青霉、木霉等常见霉菌的菌落，尖端菌丝纯化培养.培养期间，每天观察菌落生长状况，记录菌落颜色、形态变化.用插片法与载片法[17]培养菌丝，光学显微镜下观察产孢结构和孢子形态.

1.2.4 分离真菌的分子鉴定 采用真菌rDNA 18S通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)、NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)和镰刀菌属rDNA ITS特异性引物Fu1(CCGAGTTTACAACTCCCAAA)、Fu2(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行联合分子鉴定.NS1、NS8扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min， 30次循环；72 ℃ 10 min.Fu1、Fu2扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 10 min.运用NCBI中BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对扩增序列进行同源性检索.在NS1、NS8扩增序列比对结果中，选择相似性≥99.30%的种序列，通过MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统进化树[18]，步长值1 000；用Fu1、Fu2扩增序列的比对结果对进化分析结果做进一步验证[19].

1.2.5 分离真菌来源的DNA验证 分离真菌的DNA用高通量测序引物(ITS1、ITS2)扩增，扩增序列经NCBI同源性检索后确定分类归属，再与高通量测序结果中同属OTU的所有序列进行多序列BLAST相似性比对，根据高相似性OTU出现及存在情况，判断分离真菌是否源自太岁.

2 结果与分析

2.1 真菌多样性

从表1中OTU数目可知，供试太岁中真菌种类丰富；各样品的OTU数目及香农指数、Chao1指数等与预测的趋势一致，都表现为内层高于外层，说明内层的真菌多样性高于外层.另外，4个样品的覆盖率均为0.99，说明测序数据量几乎涵盖了样品所有物种，能够代表样品真实情况.

表1 4个样品的测序数据及α多样性指数1)Table 1 Sequencing data and α diversity index in 4 samples

2.2 样品间OTU关联性

从图1可以看出：样品间共有OTU仅40个，占各样品总数的比例很少；这些共有OTU在SFO2、SFO3、SFI2和SFI3样品中的相对丰度依次为66.68%、66.32%、41.01%和33.03%，样品间变幅较大，整体上外层高于内层.这说明太岁中OTU多数为非共有，且内层中含有更多与其构成无关的种类.

图1 OTU(个)在4个样品中分布的韦恩图Fig.1 Venn diagram of OTU distribution in 4 samples

2.3 真菌物种注释与菌群结构

从表2可以看出：各样品中的真菌约有10个门、100个以上的属；按相对丰度≥0.01%统计，目和属水平上的数目减少明显，特别是外层样品.这说明太岁组织无论内层还是外层，在真菌构成上都是杂合体；外层有很多相对丰度在0.01%左右的类群存在.

表2 各样品中按不同相对丰度(RA)水平统计的OTU分类数目Table 2 OTU classification of different samples based on relative abundance (RA)

门分类水平上，4个样品中相对丰度≥0.01%的门共涉及 12个，其中6个为共有(含unclassified)，除SFO3外，各包含1或2个独有门，占比最高的仅0.16%，说明不同样品间菌群不完全相同.SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中相对丰度≥1%的门分别有3、3、5和4个，子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、未分类门(unclassified phylum)为共有门，占比之和依次为99.36%、99.41%、90.86%和93.08%.子囊菌门在各样本中占比均超过70%，占绝对优势，与Li et al[4]的研究结果不同，其以未分类门为优势.

目分类水平上，4个样品中相对丰度≥0.01%的目共涉及56个，其中25个为共有，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3分别独有2、1、7和10个目.各样品独有目占比之和最高的为1.41%.SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中相对丰度≥1%的目分别有7、9、14和9个，刺盾炱目(Chaetothyriales)、散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌目(Hypocreales)、酵母目(Saccharomycetales)、未分类目(unclassified order)为共有目，占比之和依次为77.60%、91.64%、69.23%和72.83%.刺盾炱目和肉座菌目在各样品中占比均较高.

属分类水平上，4个样品中相对丰度≥0.01%的属共涉及146个，其中32个为共有，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3分别独有8、11、25和35个属.SFO2和SFO3独有属占比之和均在0.23%以下，SFI2和SFI3各为2.97%和39.33%.相对丰度≥1%的优势属共涉及27个，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中分别有11、14、17和15个(图2).

图2 各样品中相对丰度大于1%的属分布柱状图Fig.2 Genus composition of different samples with relative abundance over 1%

从图2可以看出，柱状图基部的虫草属(Cordyceps)、镰刀菌属(Fusarium)、踝节菌属(Talaromyces)、未分类属(unclassified genus)、曲霉科未分类属(unclassified Aspergillaceae)为共有属，在SFO2、SFO3、SFI2、SFI3中占比依次为20.50%、30.07%、32.86%、21.19%.同时，共有属不是各样品中占比最高的属，其占比之和均低于60%，不构成绝对优势.占比最高的外瓶霉属(Exophiala，45.33%)主要存在于外层样品中，内层样品SFI2中未检测到；占比次高的Anthopsis(22.11%)仅存在于内层样品中；占比第3的丛赤壳科未分类属(unclassified Nectriaceae, 18.92%)存在于SFI3中，SFI2中未检测到.这些结果均与太岁由真菌构成的假定相背离，因缺乏一个占比高且在组织中普遍存在的属.

2.4 共有属和高占比属内的OTU分布情况

从表3可以看出，每个属都包含多个OTU，表明存在不同的“种”.共有属中的虫草属、踝节菌属、曲霉科未分类属在各样品中均具有相同的最高丰度OTU，其占比与属占比很接近，表明其构成的主“种”相同，是真正的共有属，但其在4个样品中占比之和依次降为11.13%、11.53%、25.19%和16.14%；镰刀菌属在内层样品中具共有OTU，占比为属占比的一半，外层无共有OTU，各自占比与属占比接近，表明在不同的层次位置，该属的“种”存在大的变化；未分类属的最高丰度OTU占比与属占比相差很大，表明该属的优势由众多低占比OTU累积而成，是假共有属.其他非共有属在各样品中均有高占比的相同OTU，占比在不同样品间存在较大变幅.

表3 相对丰度≥1%的共有属和相对丰度最高值≥10%的非共有属内的OTU分布情况1)Table 3 OTU number and percentage of common genera with ≥1% relative abundance and uncommon genera with highest relative abundance being ≥10%

2.5 分离真菌的形态特征与分子鉴定

将分离真菌命名为SZB，其在PDA培养基上的菌落圆形、白色(图3A、3B)，气生菌丝薄绒状，间有墨绿色素，随传代消失；可产生圆形厚垣孢子(图3C)，形成菌丝环、菌丝巢，上附大量小孢子(图3D、3E).典型镰刀状大型分生孢子少，有的呈马特型，两端较钝，基胞有圆形足跟，具0～6个隔膜，大小为(28.2～40.6) μm×(5.8～7.2) μm；小型分生孢子多，长椭圆至卵形，有的具1个隔膜，大小为(9.6～14.7) μm×(4.3～5.3) μm，多假头生于菌丝尖端和堆积于菌丝环、菌丝巢处(图3F).

A、B.菌落正反面；C.大、小孢子与厚垣孢子；D、E.菌丝巢与小孢子；F.头状孢子堆.标尺=50 μm.图3 分离真菌菌落形态、产孢结构及孢子形态Fig.3 Colony morphology, sporogenous structure and spore morphology of the isolated strain

用引物NS1、NS8扩增SZB所得序列(SZBNS18)的GenBank登录号为MN508437.1.经BLAST比对获得高相似性同源序列，以镰刀菌属同目(肉座菌目)不同科、属的球孢虫草(Cordycepsbassiana, AB079126)、Cordycepscateniobliqua(NG062658)作外群，构建系统发育树.图4显示：所有镰刀菌属聚为一大类，支持率100%；镰刀菌属以下基本按不同的种各聚为一类，SZB与腐皮镰刀菌聚为一类，支持率为86%.

图4 基于18S rDNA 基因构建的分离菌和相似种系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of isolates and similar species based on 18S rDNA sequence

用引物Fu1、Fu2扩增SZB所得序列的GenBank登录号为MT825571，长度506 bp.比对结果显示，该序列与分离自杏鲍菇(Pleurotuseryngii)的一株腐皮镰刀菌(登录号：MK402158.1)序列的序列覆盖率(query over)为99%，期望值(E-value)为0，相似性(per. ident)为99.01%.

综合SZB的形态、系统发育树和属内序列比对结果，将其鉴定为腐皮镰刀菌(Fusariumsolani).

2.6 分离真菌来源的检验

用引物ITS1、ITS2扩增SZB所得序列(SZBITS12)的GenBank登录号为MN508438.经比对，其与镰刀菌属未定种(Fusariumsp., LN809062.1)序列同源性最高.因此，SZBITS12可与高通量测序结果中镰刀菌属OTU进行比对.

从表4可以看出，SZBITS12序列与OTU802序列相似性为100%.OTU802存在于4个样品中，在内层样品SFI2和SFI3中占比分别为0.08%和0.13%，在外层样品SFO2和SFO3中占比分别为0.33%和13.88%.这表明分离菌SZB源自太岁，不是外源污染菌.

表4 SZB与同属OTU同源性比对结果Table 4 Homology comparison of SZB and OTU from the same genus

3 讨论

3.1 真菌非均匀分布提示存在生长与环境的互作

相对丰度≥0.01%的146个属中，有114个为非共有属；≥1%的5个共有属经OTU检验后仅余3个；占比高的属在样品不同层间或同层次不同重复间跳跃性存在.这种分布不均衡特点表明太岁生长可能与环境菌群存在互作关系：太岁周边环境菌群不均衡，造成同层样品间的菌群存在差别；周边环境菌群会被处于不同生长阶段的太岁黏附和裹挟，菌群的变化导致不同层次间的菌群存在差别.这种互作导致了太岁真菌种类和丰度的多样性.4个样品中镰刀菌属的几个主OTU，在相对丰度≥0.01%时都为共有，只是由于环境变化，未形成同一OTU的优势地位.

真菌分布不均衡特点进一步印证了细菌不平衡存在的真实性[7-8].然而， “脱模物造假说”[3]和“古老有机物说”[4]均认为太岁是一个化工产品构成的静态物体，前者认为其中的菌类为加工用水携带，并未考虑脱模加工过程必有的搅拌操作会导致菌类及丰度分布的均匀化；后者则解释其中的菌类为环境渗透，并未注意到菌体难以渗入结构致密的化工胶体，即使渗入，菌群将形成以聚乙烯醇分解菌为主、整体多样性剧降的结构.这均与本研究中菌群多样性外低内高的结果不符.

3.2 真菌的土壤生境特点印证太岁出自土层

中国报道的虫草属有139个，其寄主包括昆虫纲、蛛形纲和大团囊菌属(Elaphomycessp.)[20].昆虫幼虫如蛾幼虫、金龟子幼虫、蝉若虫，成虫如蝼蛄、蚂蚁，蛛形纲的穴居蜘蛛的生境都是土层；大团囊菌更是典型的地下生态类群[21].这说明虫草属真菌广泛存在于土层中.踝节菌属、曲霉科未分类属、丛赤壳科未分类属真菌均是植物根际和土壤中常检测到的优势类群[22-23]；Naganishia则是淡水湿地生态系统中酵母菌的优势属[24]；镰刀菌属更是一类世界性分布的真菌，它可以在土壤中越冬、越夏[25-26].这些真菌以土壤为生境的构成特点，印证太岁出自土层的结论[27]是正确的.

3.3 太岁中存在一些常规真菌属于普遍现象

本研究通过DNA检验的方法除证实了腐皮镰刀菌的存在外，还检测到了枝顶孢霉属、木霉属、青霉属[9]、假丝酵母属、红酵母属真菌[10]，且为4个样品共有，相对丰度分别为1.40%、0.11%、0.21%、1.61%、1.92%；但未检测到假散囊菌属[11]、侧齿霉菌、拟青霉属[4].这说明太岁中存在常见真菌属普遍现象，该现象可由太岁以1 m深土层为主的分布规律获得解释[22]；但真菌种类会因环境的影响而存在差别，这也证明太岁中真菌是由于保藏阶段污染造成的结论[4]是错误的.综上所述，本研究认为今后应坚持以生物成因为方向对太岁进行揭秘.