番鸭呼肠孤病毒p10.8蛋白单克隆抗体的制备

屈贵蜀, 何 晴, 严梦涵, 陆芍华, 黄瑞玲, 彭瑶顺, 庄许诺, 许丽惠, 王全溪

[福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002]

番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus, MDRV)是一种具有较高致病性的双链RNA病毒[1]，其引起的番鸭呼肠孤病毒病于1950年首次报道于南非，上世纪90年代，我国福建、广东等地也发现了此病[2-5].该病主要感染雏番鸭，番鸭感染之后表现出较高的发病率和死亡率[6].在番鸭的养殖中，该病已经是影响其养殖业的重要疾病之一.值得注意的是，MDRV感染引发的高致死率与其诱导的细胞凋亡密切相关[7].研究表明，MDRV中编码的非结构蛋白p10.8能够诱导细胞凋亡[8]，且p10.8蛋白能够通过PERK/eIF2α通路诱导内质网应激，从而介导p10.8蛋白的细胞周期阻滞和凋亡[9]，p10.8蛋白诱导细胞周期阻滞和凋亡还需要Cdc20及分子伴侣CCT2和CCT5的参与[10].可见，p10.8蛋白是引起MDRV致病的关键蛋白.

单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)技术，因其特异性强、亲和力高等多种优点，被广泛应用于兽医临床的检测与治疗[11].目前，刘思伽等[12]研制了 MDRV的弱毒疫苗；朱小丽等[13]制备了MDRV的mAb，但未确定是针对何种病毒蛋白；张云等[14]制备了抗MDRV σB蛋白的mAb；朱二鹏等[15]制备了MDRV σNS蛋白的多克隆抗体；吕小婷等[4]制备了MDRV σA蛋白的多克隆抗体；庄育彬[16]制备了MDRV σC蛋白的多克隆抗体.本课题组前期研究表明，p10.8蛋白可以通过非经典途径进入细胞核，但其不具有核定位信号[17].本试验力求通过p10.8蛋白的mAb去捕获与p10.8蛋白相互作用的蛋白，从而深入了解p10.8蛋白进入细胞核的相关机制.目前，MDRV p10.8蛋白mAb的研究尚未见报道,且MDRV p10.8蛋白是其致病的关键蛋白，因此开展MDRV p10.8蛋白mAb的研究对于深入探究MDRV的致病机制具有十分重要的意义.

1 材料与方法

1.1 材料

高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)购自北京天根生化科技有限公司；6～8周龄小鼠购自福建省福州市吴氏动物贸易有限公司；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、ProteinIsoTMNi-NTA Resin蛋白纯化柱(DP101-01)、间接ELISA法所用试剂均购自北京索莱宝科技有限公司；SP2/0细胞由福建农林大学动物科学学院提供；DF1细胞、p10.8原核表达蛋白和真核表达蛋白均来自于本实验室；其余常规试剂均购自国药试剂公司.

1.2 免疫抗原的制备

参考蔡一龙[18]MDRV p10.8蛋白原核表达及蛋白纯化的方法.将本实验室保存的p10.8蛋白原核重组菌复苏，提质粒，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，在最适温度为37 ℃，IPTG最适浓度为1.0 mmol·L-1的条件下诱导24 h，使目的蛋白大量表达，收集菌液离心，变性，采用SDS-PAGE电泳检测p10.8蛋白是否表达.对诱导表达后的菌液进行离心，用PBS洗两次，加蛋白平衡液进行超声破碎，最后用Ni-NTA亲和层析法进行重组蛋白纯化，用BCA蛋白浓度检测法测定蛋白浓度.

1.3 小鼠的免疫

取饲养达7周龄的健康BALB/c小鼠，用纯化的重组p10.8蛋白作为抗原，按照抗原与弗氏佐剂的体积比为1∶1进行混合，皮下多点免疫小鼠4次(每隔两周1次)，抗原免疫剂量为50 μg·只-1·次-1.第1次免疫用1 mL抗原与弗氏完全佐剂的混合液(1∶1)，第2、3次用抗原与弗氏不完全佐剂的混合液(1∶1)，共1 mL.前3次均采用背颈皮下注射，第3次免疫后尾静脉采血，分离血清，用Western blotting法检测血清抗体效价.达到合格效价后，腹腔注射纯化后的抗原(50 μg·只-1)以加强免疫.3 d后采用拉颈的方法将小鼠处死，无菌取出脾脏，用于后续的细胞融合试验.

1.4 细胞融合与阳性杂交瘤细胞株的筛选

细胞融合的前一天，将未免疫的小鼠腹腔巨噬细胞铺在10块96孔板上作为饲养细胞.融合当天，在无菌条件下取小鼠脾脏，分离脾细胞，将脾细胞用5 mL离心管收集起来，并计数.将处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0从培养箱取出，离心，计数，按照脾细胞∶SP2/0细胞以10∶1的数量比进行混合.将PEG诱导剂和DMEM培养基分别用水浴锅(37 ℃)预热，取1 mL PEG诱导剂加入到脾细胞和骨髓瘤细胞的混合液中，由慢到快，60 s内加完.在加入的同时需要搅拌或者摇晃，加完之后再摇1.5 min.在5 min内加入10 mL DMEM培养液，然后再加40 mL DMEM培养液，离心，去上清.加入10 mL HAT培养液，按每孔100 μL的量分装于24孔板中并放入细胞培养箱中培养.融合10～15 d后，用间接ELISA法检测细胞上清效价，挑选D450 nm高的、细胞生长旺盛且形态好的、没有交叉反应的阳性孔，转移到24孔板中.第2天观察细胞生长情况，选取细胞生长状况好的进行计数.采用有限稀释法，经3次连续克隆化，直至板中各孔阳性率达100%，进行克隆化的过程中各阶段细胞需要扩大培养并收集上清.

1.5 p10.8 mAb特异性鉴定

1.5.1 mAb的Western blotting鉴定 以p10.8 mAb阳性细胞株培养的上清为一抗，分别与原核表达、真核表达的p10.8蛋白进行Western blotting反应；另取MDRV、禽腺病毒(FAdV)和鸭坦步苏病毒(DTMUV)全病毒与mAb细胞培养的上清进行反应.试验均同时设置阴性对照检测其生物学活性.

1.5.2 mAb效价及亚类的测定 取阳性克隆株细胞培养上清，用间接ELISA法检测抗体效价；按照齐一生物科技(上海)有限公司的单克隆抗体亚类检测试剂盒说明书的方法检测抗体亚类.

2 结果与分析

2.1 pET-32a-p10.8原核重组蛋白的表达及纯化

将重组质粒pET-32a-p10.8转化BL21(DE3)感受态细胞24 h，分别以p10.8基因的上下游引物、T7的上下游引物、p10.8基因的上游引物和T7的下游引物、T7的上游引物和p10.8基因的下游引物进行PCR扩增鉴定，在预期的相应位置出现特异性条带(图1A).SDS-PAGE检测结果显示，p10.8蛋白被诱导表达，其特异性条带位于预期大小的28.8 ku处(图1B)，纯化效果好，杂蛋白少(图1C).

A:重组质粒转化BL21的PCR鉴定(M：2 000 bp DNA Maker;1：p10.8基因的上下游引物;2：T7的上下游引物;3：p10.8基因的上游引物、T7的下游引物;4：T7的上游引物、p10.8基因的下游引物)；B:重组菌的诱导表达(M：180 ku蛋白Maker;1：上清;2：沉淀;3：pET-32a空载体表达组)； C:重组菌的纯化(M：180 ku蛋白Maker;1：pET-32a空载体表达组;2：抗原的纯化).图1 p10.8蛋白原核表达及纯化的检测结果Fig.1 Prokaryotic expression and purification of p10.8 protein

2.2 小鼠阳性血清效价检测结果

Western blotting检测结果表明，3免后小鼠血清效价达1∶32 000(图2).对小鼠阳性血清进行梯度稀释至1∶256 000，采用间接ELISA法进一步检测血清的酶标值(D450 nm)以判定其效价.结果(表1)显示，效价在1∶256 000时，免疫组血清的酶标值仍达0.811 5.

1：PBS空白对照组，2：p10.8原核表达蛋白组.图2 血清效价达1∶32 000的Western blotting鉴定结果Fig.2 Western blotting of serum titered at 1∶32 000

表1 阳性血清效价的ELISA检测结果1)Table 1 ELISA test of positive serum

2.3 杂交瘤细胞筛选结果与融合细胞上清效价检测结果

对融合细胞上清进行ELISA检测，以待检孔值∶阴性孔值≥2判定为阳性，挑选比值高的阳性孔进行3次克隆化.第1次克隆化检测到12孔的阳性，结果如表2所示；第2次克隆化检测到6孔的阳性，结果如表3所示；第3次克隆化检测到2孔的阳性，结果如表4所示.3次克隆化检测结果表明，总共筛选到2孔阳性，分别是3-3B和3-7B.

表3 第2次克隆化检测的阳性结果Table 3 Positive selection after 2nd cloning

表4 第3次克隆化检测的阳性结果Table 4 Positive selection after 3rd cloning

2.4 mAb与p10.8蛋白的特异性鉴定结果

将第3次克隆化检测为阳性孔的3-3B和3-7B上清做1∶2 000稀释，然后均与原核表达和真核表达的p10.8蛋白进行Western blotting检测，同时设置His和Flag标签蛋白作为对照.结果显示，只有3-7B孔的上清能同p10.8蛋白发生特异性反应，将此杂交瘤细胞株命名为H3-7B株.图3显示，H3-7B株mAb能与p10.8原核表达、真核表达蛋白发生反应.其中，原核表达p10.8蛋白与mAb发生反应后，其特异性条带位于28.8 ku处，与预期结果相符(图3A)；与真核表达蛋白发生反应后，特异性条带位于预期的12.8 ku处(图3B).表明该H3-7B株mAb是p10.8的mAb.

A:细胞上清与原核表达蛋白的Western blotting鉴定(1：PBS空白对照组;2：p10.8原核表达蛋白组)；B:细胞上清与真核表达蛋白的Western blotting鉴定(1：空细胞对照组;2：p10.8真核表达蛋白组).图3 mAb与p10.8蛋白的特异性鉴定结果Fig.3 Specificity identification of mAb and p10.8 protein

2.5 mAb与MDRV、禽腺病毒、鸭坦步苏病毒全病毒的反应结果

图4显示，杂交瘤细胞H3-7B株上清能与MDRV全病毒发生反应，而不能与禽腺病毒、鸭坦步苏病毒全病毒发生反应，表明该mAb对MDRV病毒具有良好的特异性.

图4 3种病毒与杂交瘤细胞上清的反应性鉴定结果Fig.4 Reactivity identification of 3 viruses and hybridoma supernatants

2.6 mAb效价及亚类鉴定结果

对mAb的亚类进行分析，测定酶标值(D450 nm).结果(表5)表明，H3-7B株mAb亚型为IgG2a类.

表5 mAb亚类鉴定结果1)Table 5 Identification of mAb subclass

3 讨论

MDRV感染后侵袭的器官主要是肝脏和脾脏，以靶器官出现灰黄、灰白色坏死点为主要临床特征[19].MDRV有多个开放阅读框(ORF)，编码多种蛋白，共同参与病毒的复制和感染，其中，p10.8蛋白是导致该病的重要蛋白之一.p10.8蛋白也是一种可诱导细胞凋亡的非结构蛋白，由MDRV S4基因片段的ORF1编码[20-21].研究表明，p10.8蛋白能够通过内质网应激等多种途径诱导细胞发生凋亡和周期停滞[22]，然而目前仍然多采用真核表达载体上的标签蛋白抗体来进行研究.因此，制备抗MDRV p10.8的抗体对于MDRV分子致病机制的研究具有十分重要的意义.

本试验采用常规免疫法对小鼠进行3次免疫，第4次免疫后取阳性血清效价高的脾细胞与SP2/0进行融合，并用间接ELISA法检测细胞上清的效价，连续亚克隆，获得高效价的mAb H3-7B株，该抗体特异性强.陈桂华等[23]在制备猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白的mAb时，将抗PCV3 Cap蛋白mAb和抗His标签抗体分别作为一抗进行Western blotting鉴定，并在相应位置出现特异性条带.唐泽群等[24]采用chTLR3重组真核质粒为免疫原，制备了抗chTLR3的mAb，并用原核蛋白等进行生物学活性特异性鉴定.贾晓雪等[25]在制备和鉴定抗牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白mAb时，曾用IBRV全病毒和重组蛋白对抗体特异性进行鉴定.本试验则采用重组原核表达蛋白作为免疫原制备mAb，用Western blotting法对重组原核蛋白、重组真核蛋白与两者相应的标签蛋白His、Flag进行特异性鉴定，并对MDRV全病毒均进行了特异性鉴定，mAb均发生了良好的特异性反应，也证明了本试验所制备的mAb具有良好的生物学活性，且用重组真核蛋白和全病毒抗原检测可以更好地排除His标签所带来的干扰.可见，本试验制备的mAb具有良好的特异性.