桑色素对高尿酸血症模型小鼠肝肾功能及血糖和血脂水平的影响及其机制

2021-10-07周启蒙赵晓悦孔德文宋俊科杜冠华

中国药理学与毒理学杂志 2021年8期

周启蒙，赵晓悦，孔德文，张森，张雯，宋俊科，杜冠华

（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050）

高尿酸血症是一种体内嘌呤代谢失衡引起的代谢性疾病［1］，核心特征是血清尿酸（uric acid，UA）水平男性＞420 μmol·L-1，女性＞360 μmol·L-1。根据2020年流行病学调查结果显示，我国高尿酸血症患患者约占全国人数13.3%，是仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病［2］。随着生活水平的提高，患者会越来越多。此外，高尿酸血症也是痛风发生发展的核心阶段，严重高尿酸血症患者发展为痛风的风险明显高于轻度高尿酸血症患者［3］。

目前用于治疗高尿酸血症的药物主要有黄嘌呤氧化酶抑制类、促尿酸排泄类和尿酸酶类药物，均存在各自的局限性。竞争性黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇（allopurinol）对亚洲人群HLA-B＊5801表型有相对高发的严重超敏反应综合征不良反应；非竞争性抑制剂非布司他的心血管不良风险限制了其临床应用。促尿酸排泄类对肝肾功能有一定要求，此外还有继发性结石风险；尿酸酶类药物注射给药的给药方式及对应引发的注射反应、个体应答差异亦均限制了临床使用。因而发现不良反应更小的黄嘌呤氧化酶抑制剂是今后此类药物的研发方向之一，寻找能温和降低尿酸的黄嘌呤氧化酶抑制剂有着重要意义。

桑色素（morin），又称3，5，7，2′，4′-五羟黃酮，常见于桑科植物的树皮，来源广泛［4］。已有研究表明，桑色素具有抗炎［5-8］、抗氧化［9-13］和抗肿瘤［14-17］等多种药理活性。研究发现，桑色素与铜、锌、钴、镍等二价金属离子作为催化核心的有关蛋白合成、核酸转录等酶有良好的结合活性［18-22］。尿酸生成的关键酶黄嘌呤氧化酶亦是钼离子作为催化核心，由此推测桑色素可能对黄嘌呤氧化酶有一定的结合作用，但目前关于桑色素对高尿酸血症改善作用的研究较少。本研究探讨桑色素对高尿酸血症模型小鼠肝肾功能及血糖和血脂水平的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

桑色素（纯度≥85%，批号：MKCG0114）和氧嗪酸钾（纯度：97%，批号：STBF6670V），美国Sigma公司；羧甲纤维素钠（CMC-Na，300-800 mPa·s，批号20130314），国药集团化学试剂有限公司；黄嘌呤、别嘌呤醇、苯溴马隆和黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO，货号X4500），美国Sigma Aldrich公司；WST-1，日本同仁化学公司；UA、肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、白蛋白（albumen，ALB）、谷丙转氨酶（glutamate pyruvate transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetate transaminase，GOT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、血糖（glucose，GLU）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）和总胆固醇（cholesterin，CHO）检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；其他试剂均为市售国产分析纯。高速冷冻离心机（AllegraTMX-22R），美国Beckman Coulter公司；生化分析仪（TBA-40），日本东芝公司；多功能酶标仪（Spectra max M5），美国Molecular Devices公司。

1.2 溶液配制

① 焦磷酸钠（SPP）缓冲液：将0.1 mol·L-1焦磷酸钠加入1 L双蒸水中，加入0.3 mmol·L-1EDTA，超声溶解，调pH至8.3，临用前配置。②WST-1工作液：将400 μmol WST-1加入1L双蒸水中，避光保存，临用前配置。③黄嘌呤工作液：将2 mmol·L-1黄嘌呤加入1 L双蒸水中混匀。④XO工作液：将2.5×103U·L-1酶液用缓冲液稀释为15 U·L-1备用。⑤桑色素工作液：将桑色素用双蒸水样度稀释为3×10-3，1×10-3，3×10-4，1×10-4，3×10-5，1×10-5，3×10-6，1×10-6，3×10-7和 1×10-7mol·L-1溶液备用。⑥ 氧嗪酸钾混悬液（300 mg·kg-1，造模剂）：将氧嗪酸钾用1% CMC-Na溶液配成60 g·L-1备用。⑦别嘌呤醇组（25 mg·kg-1，阳性对照）、苯溴马隆组（25 mg·kg-1，阳性对照）和桑色素（25，83和250 mg·kg-1）组：药物分别用1% CMC-Na溶液分别配成5，17和50 g·L-1备用。

1.3 双波长动态监测法检测XO活性抑制率和自由基清除率

体外检测体系分为标准组、对照组和检测组。首先在黑色透明底384孔板中每孔添加12.5 μL WST-1工作液和12.5 μL黄嘌呤工作液，标准组每孔添加5 μL SPP缓冲液，对照组每孔添加25 μL SPP缓冲液，检测组分别每孔添加5 μL桑色素工作液。每浓度4个平行样，混匀。最后除对照组外，每孔加入20 μL XO工作液，混匀后立刻使用多功能酶标仪检测295 nm处吸光度（A295nm）在20 min内动态反应的斜率（S295）及20 min后的A450nm。用S295计算XO活性抑制率。XO活性抑制率（%）=（标准管S295-检测管S295）/（标准管S295-空白管S295）×100%；自由基清除率（%）=（标准管A450nm-检测管A450nm）/（标准管A450nm-空白管A450nm）×100%。

1.4 动物、分组、模型制备和血清制备

70只雄性SPF级KM小鼠，体重18～20 g〔北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011〕，置温控21～25℃、光控（12 h光暗循环）、湿控（相对湿度20%～50%）的动物实验室中适应性饲养3 d。相关动物实验方案符合中国医学科学院药物研究所动物伦理委员会要求。小鼠分为7组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、模型+桑色素25，83，250 mg·kg-1组，模型+阳性药别嘌呤醇25 mg·kg-1组和模型+阳性药苯溴马隆各25 mg·kg-1组。适应性饲养结束后，每3～5 d记录1次小鼠体重。除正常对照组外，其余小鼠ip给予氧嗪酸钾300 mg·kg-1，连续7 d。眼球后静脉丛取血抽样检测血清UA水平，模型与对照组血清UA水平与对照组相比有显著升高即模型制备成功。成模后维持每日ip给予氧嗪酸钾300 mg·kg-1。模型小鼠按照分组分别ig给予相应药物，连续14 d。小鼠在末次给药1 h后，经眼球后静脉丛取血0.8 mL，而后处死小鼠。血样室温自然凝固，随后4℃，2300×g离心15 min，吸取上清后于-40℃冰箱保存。肝、肾取出后称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器重量（g）/体重（g）×100。

1.5 生化试剂盒检测小鼠肾功能和肝功能相关指标

取1.4分组取材处理后获得的血清样本，按照试剂盒说明书，使用生化仪检测血清UA、CRE、BUN、ALB、GLU、LDL-C、HDL-C、TG、CHO含量及GPT、GOT、LDH活性。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 桑色素体外对XO活性的抑制作用及对自由基的清除作用

如图1A所示，桑色素体外抑制XO活性最高抑制率为65%，IC50为3.72×10-4mol·L-1；图1B所示，桑色素对自由基清除率最高为26.7%，EC50为2.3×10-4mol·L-1。

2.2 桑色素对高尿酸血症小鼠体重的影响

从图2可见，在实验期间，正常对照组、模型对照组、模型+桑色素25，83和250 mg·kg-1组，模型+阳性药别嘌呤醇25 mg·kg-1组及模型+阳性药苯溴马隆25 mg·kg-1组小鼠体重无显著差异。

2.3 桑色素对高尿酸血症模型小鼠肾功能的影响

从表1可见，与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清UA显著升高（P＜0.01），肾指数、CRE和BUN均无显著变化。与模型对照组相比，模型+桑色素250 mg·kg-1组血清UA和BUN水平均显著降低（P＜0.01）；模型+阳性药别嘌呤醇25 mg·kg-1组血清UA水平显著降低（P＜0.01）、血清BUN显著升高（P＜0.05）；模型+苯溴马隆25 mg·kg-1组血清UA水平显著降低（P＜0.01），其他肾功能指标均无显著差异。模型+桑色素250 mg·kg-1组血清UA水平与模型+阳性药苯溴马隆组相比无显著差异。

Fig.1 Effect of morin on xanthine oxidase（XO）inhibition and oxygen radical scavenging.The in vitro detection system was divided into the standard group，control group and detection group.A multifunctional microplate reader was used to detect the dynamic response slope（S295）of the absorbance at 295 nm（A295 nm）within 20 min and the A450 nmafter 20 min.XO activity inhibition rate（%）=（standard tubes S295-assay tubes S295）/（standard tubes S295-blank tubes S295）×100%；free radical scavenging rate（%）=（standard tubes A450 nm-assay tubes A450 nm）/（standard tubes A450 nm-blank standard tubes A450 nm）×100%。A：the xanthine oxidase inhibitor rate of morin；B：the oxygen radical scavenging rate of morin.±s，n=4.

Fig.2 Effect of morin on weight of mice during the experiment.Adaptable feeding for 3 d，the mice were randomly divided into 7 equal groups，which were the normal control group，the model group，and the morin 25，83，and 250 mg·kg-1 groups，positive drugs allopurinol and benzbromarone 25 mg·kg-1 groups.After adaptive feeding，the weight of the mice was recorded every 3 or 5 d.Except for the normal control group，the rest of the mice were ip given potassium oxazinate 300 mg·kg-1 for 7 d to prepare a mouse hyperuricemia model in which the level of serum uric acid（UA）in the posterior venous plexus is significantly higher than that in the normal control group.After the model formed，the mice were still ip given potassium oxazinate 300 mg·kg-1.Model mice were given morin 25，83，250 mg·kg-1and positive drugs 25 mg·kg-1each of allopurinol and benzbromarone by Intragastric administration according to their groups for 14 d.Organ index=total organs（g）/weight（g）×100.±s,n=10.

2.4 桑色素对高尿酸血症模型小鼠肝功能的影响

如表2所示，给药2周后，与正常对照组相比，模型对照组肝指数、GPT、GOT、LDH、ALB均无显著性差异。与模型对照组相比，模型+桑色素3个剂量组和模型+阳性药组GOT和ALB无显著差异；25和250 mg·kg-1组GPT水平显著降低（P＜0.01）；模型+桑色素250 mg·kg-1LDH水平显著降低（P＜0.01）。与模型对照组相比，模型+阳性药组肝指数各指标均无显著差异。

Tab.1 Effect of morin on renal function of model mice with hyperuricemia

Tab.2 Effect of morin on liver function of model mice with hyperuricemia

2.5 桑色素对高尿酸血症模型小鼠血糖和血脂水平的影响

由表3可见，给药2周后，与正常对照组相比，模型对照组随机血糖升高15%，血脂各指标升高5%～40%，但均无显著差异。模型+桑素色3个剂量组与模型组相比，GLU和血脂各指标均无明显差异。

3 讨论

本研究实验结果显示，桑色素对黄嘌呤氧化酶有明显的抑制作用，其 IC50为 3.72×10-4mol·L-1。动物实验结果显示，模型组动物po给予桑色素250 mg·kg-1后血清UA明显降低，作用与苯溴马隆无显著差异。

高尿酸血症模型小鼠血清BUN、GPT和LDH水平明显升高，给予桑色素对高尿酸血症KM小鼠血清BUN水平及GPT和LDH活性有良好的降低作用，提示桑色素对肝、肾功能可能有一定保护作用。阳性药别嘌呤醇对上述指标无明显作用，与模型组相比无显著差异，提示别嘌呤醇对肝、肾功能无明显改善。

有报道，UA与糖脂代谢、肥胖等密切相关［23-27］，且在糖脂代谢信号通路的调控作用中起重要作用［28-29］，这提示调节血糖血脂对UA水平可能存在影响。另有报道，桑色素可激活能量代谢相关的环磷酸腺苷/蛋白激酶A/腺苷酸激活蛋白激酶/沉默信息调节因子（cAMP/PKA/AMPK/SIRT1）通路［24］，提示桑色素对机体血糖血脂水平有一定调节作用，但本研究结果显示，桑色素对高尿酸血症KM小鼠血清糖脂水平并未表现出直接显著改善作用，其降UA作用可能与其他因素相关。