N6-甲基腺嘌呤修饰异常对女性生殖系统疾病的影响

熊佳丽，薛平平，周怀君

(1.南京医科大学鼓楼临床医学院妇产科，江苏 南京 210008；2.南京医科大学附属常州妇幼保健院妇产科，江苏 常州 213000；3.南京医科大学附属常州妇幼保健院生殖中心，江苏 常州 213000)

表观遗传是指在不改变基因组DNA序列，但基因表达发生了可逆且可遗传化的变化，主要包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和RNA甲基化等，这种基因表达的变化参与了人类重要的生命进程。目前，在生物体内已经鉴定出超过150种的RNA修饰[1]，其中甲基化修饰是最主要的RNA表观遗传学修饰。甲基化修饰主要包括N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine，m1A)、N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)等；其中，m6A甲基化修饰又是mRNA中最丰富的转录后修饰。近年来，随着越来越多m6A甲基化修饰相关领域研究的涌现及鉴定、检测技术的发展，证实m6A甲基化参与并影响了恶性肿瘤及内分泌系统、神经系统、女性生殖系统疾病的发生和发展进程[2-3]。以m6A为代表的RNA表观遗传修饰成为当今生命科学研究的前沿和热点之一[4]，现对m6A修饰参与的女性生殖系统疾病及恶性肿瘤等进行阐述，并对其机制进行探讨，旨在为保障女性生殖健康提供新的研究策略。

1 m6A的简介

1.1 m6A修饰的概念

m6A甲基化是指m6A甲基转移酶复合体，利用S-腺苷酸甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将碱基A第6位上的氢甲基化。真核生物RNA上超过50%的表观遗传修饰是以m6A为主的。自2011年何川实验室发现了第1个m6A去甲基化酶肥胖相关基因(fat mass and obesity-associated protein，FTO)，m6A相关蛋白的研究拉开了帷幕。同时伴随着鉴定技术及高通量测序技术的发展，逐渐完成了m6A分布图谱的精确绘制，并发现m6A分布富集于mRNA蛋白质编码区(coding sequence，CDS区)、3′-非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)、长的外显子区域、终止密码子与剪切位点附近，参与调控mRNA的稳定性、转录、可变剪接、结构、定位、降解、翻译效率及核转运等功能，在转录后层面参与真核基因的表达调控，此外还参与细胞代谢重塑、细胞分化和生物节律维持，导致一系列生理或病理效应，从而影响人体生命生理过程[5]。

1.2 m6A修饰的相关蛋白

m6A受甲基转移酶(“Writers”，编码器)、去甲基化酶(“Erasers”，消码器)和结合蛋白(“Readers”，读码器)这三种效应蛋白的调控，见图1。

图1 m6A的甲基化和去甲基化示意图Fig.1 The process of m6A methylation and demethylation

1.2.1 关于编码器

“编码器”是指m6A甲基化转移酶，催化m6A的甲基化修饰。m6A甲基化修饰是由多种蛋白组成的甲基转移酶复合体完成的。利用串联亲和沉淀结合质谱分析、免疫荧光共聚焦显微镜技术及基于光交联免疫共沉淀技术的测序技术等，发现甲基转移酶复合体主要由甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like 14，METTL14)、肾母细胞瘤1结合蛋白相关蛋白(wilmstumor 1-associatedprotein，WTAP)等相关蛋白组成，其中METTL3是最早被鉴定的m6A甲基转移酶组分，同时也是甲基转移酶复合体的核心组分。

1.2.2 关于消码器

“消码器”是指m6A去甲基化酶，介导m6A的去甲基化修饰过程。目前在哺乳动物体内被发现的去甲基化酶，有FTO和ALKB同源蛋白5(AlkBhomolog 5，ALKBH5)，两者均是二价铁、α-酮戊二酸盐依赖型双加氧酶ALKB家族蛋白成员，即需要依赖辅因子Fe2+和α-酮戊二酸来催化m6A去甲基化活性。

1.2.3 关于读码器

“读码器”是指甲基结合蛋白，是一组识别m6A修饰信息的蛋白。m6A虽然是受甲基化酶和去甲基化酶动态调控，但m6A的生物学功能主要通过其结合识别蛋白实现。由此可见，m6A功能性调节转录组及参与生物学的过程，在很大程度上取决于其结合蛋白的有效识别。目前发现的m6A结合蛋白主要有YTH结构域家族蛋白、异质性胞核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族蛋白成员、真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIf3)及胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-likegrowth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs)。这些蛋白可选择性地结合到m6A修饰的序列上，分别调控相关mRNA介导的生物学功能，见表1。

表1 m6A结合蛋白的种类和功能Table 1 Types and functions of m6A binding proteins

2 m6A修饰对女性生殖健康的影响

m6A是人体内最主要的RNA修饰方式，由于m6A动态可逆地调控着各种生命进程，其含量异常升高或降低均可导致不同疾病的发生。m6A对女性生殖健康，包括早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)、多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)、女性生殖系统恶性肿瘤等疾病有着重要的影响。

2.1 m6A修饰与女性生殖内分泌疾病

女性生殖内分泌疾病是妇科常见病，主要是由于下丘脑-垂体-卵巢轴异常所致，此外还涉及环境、遗传等因素。随着表观遗传学的深入研究，发现m6A修饰也与该类疾病存在一定的关系。

2.1.1 m6A修饰与早发性卵巢功能不全

POI指女性40岁以前出现卵巢功能衰退，以促性腺激素升高及雌激素缺乏为特征，主要表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)，最终逐渐发展为以闭经和不同程度的围绝经期症状为主要表现的卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)[6]，并影响女性卵泡发育、成熟，进而影响育龄女性的生育及日常生活。虽然多数POI患者的发病原因尚不完全明确，但Xia等[7]的相关实验指出，Zmettl3m/m斑马鱼(靶向METTL3外显子的合子缺陷突变系)的卵母细胞发育滞缓，多数依然停留在早期阶段，m6A修饰显而易见地影响着卵泡成熟率；实验中同时指出，由于Zmettl3m/m斑马鱼的卵母细胞中m6A含量明显下降，引起其体内性激素合成与促性腺激素信号转导相关的关键因子无法正常表达，从而使得子代胚胎中11-酮基睾酮和17β-雌二醇分泌下降，最终导致配子成熟障碍和生育能力下降。还有研究提出，有YTH结构域含蛋白(YTH domain containing，YTHDC)缺陷的卵母细胞停滞于早期阶段，而YTHDC1的缺失致使卵母细胞内出现大量的选择性多腺苷酸，改变了mRNA3′UTR长度，无法正常与甲基结合蛋白相结合，失去了甲基结合蛋白的有效识别后，显著降低了转录稳定性，并干扰mRNA的正常翻译，显著降低了卵泡成熟率[8]。以往的临床调查发现，与卵巢储备功能正常患者相比，POI患者的颗粒细胞中m6A含量明显升高，并伴随着FTO表达的下降；体外细胞实验发现，利用siRNA抑制人卵巢颗粒细胞中FTO的表达后，颗粒细胞中m6A含量升高，增殖活力下降、凋亡增加，同时FOXL2+、FSHR+、CYR19A1+、AMH+的细胞比例均显著下调[9]。FTO可能成为POI的潜在新型生物标志，为POI提供新的诊疗方案。

2.1.2 m6A修饰与多囊卵巢综合征

PCOS是由于女性生殖内分泌系统失调引起的一系列病征，常见于育龄期妇女。PCOS主要有月经紊乱、卵巢呈多囊性改变、卵巢排卵功能障碍、胰岛素抵抗、肥胖、高雄激素和不孕等临床表现，从而严重地损害了女性的正常生殖功能及身心健康[10]。由于PCOS患者临床表现存在普遍的个体特异性及种族的差异性，由此不难推测，PCOS的发生及发展受多种因素的影响。木良善等(2018年)研究认为，肥胖与PCOS可能存在互为正相关的联系。FTO是第1个被发现的肥胖候选基因，位于人类染色体16q12.2，并被广泛验证与体质量指数(body mass index，BMI)和肥胖的发生息息相关；但是关于FTO基因上的多态位点与PCOS的相关性研究结论不一致。有研究指出，FTO基因中的rs8050136、rs1588413与PCOS的易感性有一定关联，具有这两个位点的妇女卵泡发育或排卵虽然有不同程度的障碍，但植入率高于其他基因型[11]。而在过去一些更早不同地域的相关研究中，针对FTO基因中的另外一个位点rs9939609，是否与PCOS发病率有相关性，则存在截然不同的观点。这些研究间的差异，一方面有可能来源于研究对象的种族不同，另一方面亦可能来源于PCOS诊断标准及研究方法的不同。但不难推断FTO是可以不依赖于BMI或肥胖独立影响PCOS的因素之一。另外，FTO同时又作为一种m6A去甲基化酶，FTO基因异常可引起m6A修饰出现异常，但若要证实PCOS与m6A甲基化的关联性，尚需行更大样本量的病例-对照研究。

2.2 m6A修饰与女性生殖系统恶性肿瘤

女性生殖系统肿瘤能严重损害育龄期女性的生育功能，引发不孕，或者导致不良妊娠结局，恶性肿瘤还会危及女性的生命健康。m6A甲基化与女性生殖系统恶性肿瘤有着紧密的关系，m6A甲基转移酶、去甲基化酶、结合蛋白异常都有可能导致恶性肿瘤的发生发展。

2.2.1 m6A修饰与子宫内膜癌

子宫内膜癌为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一。近年来，子宫内膜癌的发病率在世界范围内呈上升趋势。据2015年国家癌症中心统计，我国子宫内膜癌的发病率为63.4/10万，死亡率为21.8/10万。Liu等[12]研究发现，约70%子宫内膜癌组织呈低水平的m6A甲基化，并提出m6A甲基转移酶METTL14(R298P)突变和METTL3的表达下调，降低了AKT信号通路负性调节分子PHLPP2的表达，同时mTORC2的表达升高，从而增强了AKT信号通路活性，而AKT信号通路的活化可促进子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和致癌性。m6A甲基化可能参与了子宫内膜癌的发生发展。但鉴于目前相关研究数据的欠缺，其具体发病机制仍待进一步的研究。

2.2.2 m6A修饰与宫颈癌

宫颈癌是常见的妇科生殖恶性肿瘤，高发年龄为50～55岁，并且有年轻化趋势。Zhou等[13]研究发现，m6A去甲基化酶FTO在宫颈鳞状细胞癌中呈高表达，并可能通过降低β-链蛋白(β-catenin) mRNA的m6A甲基化，促进β-catenin的表达，从而引起切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementary group 1，ERCC1)水平上升，导致宫颈癌放化疗的敏感性降低，影响宫颈癌患者的预后，提示FTO可能作为宫颈癌患者临床预后评估的一项指标。Wang等[14]对286例宫颈癌患者的研究发现，较于相邻的正常组织，宫颈癌组织中的m6A甲基化处于显著低水平；敲低宫颈癌细胞中m6A的METTL3和METTL14，或者过表达m6A去甲基化酶(FTO和ALKBH5)，可下调m6A甲基化水平，增强肿瘤细胞增殖活力；相反，敲除FTO和ALKBH5后，可上调m6A甲基化水平，抑制肿瘤细胞增殖。综上可以推断，m6A甲基化与宫颈癌有密不可分的关系，而且m6A修饰的关键酶可能成为宫颈癌患者的诊断及临床预后评估的一项指标。

2.2.3 m6A修饰与卵巢癌

在我国，卵巢癌的发病率居妇科恶性肿瘤第3位。由于卵巢癌早期无特异性症状，筛查有限，早期诊断有较大困难，大部分患者就诊时多为晚期。晚期卵巢癌的疗效通常不理想，故死亡率居妇科恶性肿瘤之首。X染色体失活特异性转录因子(X inactive specific transcription factor，XIST)为一种长链非编码RNA，是哺乳动物X染色体大部分基因去活化的主要影响因子，也是X染色体启动最早的转录基因。XIST失活可诱发肿瘤，XIST与卵巢癌存在密切的关联性。人类细胞中的XIST呈高度甲基化水平。RNA结合基序蛋白15(RBM15)及其类似物RBM15B，可以富集METTL3，从而实现了对XIST的甲基化修饰；当RBM15和RBM15B过表达时，XIST则会抑制X基因的沉默化[15]，引发卵巢癌。Hua等[16]检测到卵巢癌患者肿瘤组织中METTL3高表达，并发现过表达METTL3可促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭；而敲低METTL3，则反之。该研究提示，METTL3能够通过激活重组AXL受体酪氨酸激酶诱发卵巢癌细胞的细胞上皮细胞-间充质细胞的转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促进卵巢癌细胞的侵袭和转移；m6A修饰不但与卵巢癌相关，且其甲基转移酶METTL3在卵巢癌的表达水平与卵巢癌的发生、分期、转移、预后密切相关。

3 小结与展望

RNA表观遗传学对女性生殖系统影响的相关研究已逐渐成为近年来的热门话题。而在100多种不同的RNA化学修饰中，m6A修饰处于尤其重要的地位。各种检测技术的发展也逐渐揭开m6A的神秘面纱。通过这些技术认识到，m6A修饰受到“编码器”和“消码器”共同动态的可逆调控，并通过不同“读码器”的识别作用，调控RNA的转录、剪接、加工、稳定性、翻译和衰变，从而参与女性生殖系统相关疾病的发生，甚至恶性肿瘤的发展和转移。同时，这些检测方法也为疾病患者的早期诊断、早期治疗提供了新的方向。虽然对m6A进行了不断深入的研究，但还存在一些问题。例如，由于m6A同时受到“编码器”和“消码器”的动态调控，并通过具有不同功能“读码器”特异性的精密调控RNA加工过程。目前尚缺乏对m6A进行动态监测的检测技术，所以m6A修饰在疾病发展过程中的一些潜在机制还有待于进一步探索。这对现有的检测技术而言是新的挑战，也是必然的发展趋势。此外，尽管有研究证实某些m6A抑制剂在部分其他系统肿瘤的治疗研究方面显示出可喜的成果[17]，但目前尚缺乏对女性生殖系统恶性肿瘤治疗的相关深入研究，这也正是继续努力的方向。期待在不久的将来，m6A抑制剂能充分应用在女性生殖诊疗方面，为女性生殖健康保驾护航。