东乡野生稻对稻曲病抗性鉴定与分析

胡建坤，黄 蓉，李湘民，刘永锋，曹志斌，黄瑞荣*

（1.江西省农业科学院 植物保护研究所，江西 南昌 330200；2.江苏省农业科学院 植物保护研究所，江苏 南京 210014；3.江西省农业科学院 江西省超级水稻研究发展中心，江西 南昌 330200）

【研究意义】水稻稻曲病是由稻绿核菌（Ustilaginoidea virens（Cooke）Takaheshi）引起的一种水稻中后期穗部真菌病害[1]，发病时在水稻穗部形成稻曲球，不仅导致水稻产量的下降[2]，还严重影响稻米品质[3]。20世纪80年代以后随着密穗型杂交水稻大面积的推广和氮肥的过量使用，稻曲病在我国各大水稻主产区逐年加重[4]，给水稻生产安全带来了严重威胁。伴随着劳动力成本的提高，人们对食品安全的日益重视及对环境保护的迫切需要，种植抗病品种成为最为经济有效安全的抗病措施，而抗性资源筛选是抗病育种工作的基础[5]。【前人研究进展】冯爱卿等[6]研究发现广东57个已审定的水稻品种对稻曲病抗感比为19.3∶80.7，高感品种达34 个，表明广东审定品种大多为感稻曲病品种。兰波等[7]研究发现江西16 个“籼改粳”候选品种中甬优系列品种大多数都易感稻曲病，只有池优65等4个品种对稻曲病有一定抗性。余山红等[8]研究表明浙江省水稻主栽品种对稻曲病的抗性水平较低，杂交水稻品种尤其感病。缪建锟等[9]研究发现辽宁省200个水稻主栽品种对稻曲病抗∶中∶感比值分别为19.5∶43.5∶37，整体抗病性较差。上述研究结果表明截至目前我国水稻主产区普遍存在主栽品种或审定品种抗稻曲病性较差的问题，抗稻曲病种质资源也比较匮乏。【本研究切入点】东乡野生稻（简称东野，下同）具宿根（多年生），再生力和繁殖（无性）力强，抗逆性强，含广亲和基因、恢复基因、抗病虫基因等多种有利基因[10]。姜文正等[11]指出东野多数群落对黄矮病免疫，抗白叶枯病、稻瘟病，半数以上群落对白叶枯病、细条病表现多抗。黄瑞荣等[12]发现东野易感稻瘟病，但对白叶枯病和细条病抗性好，同时发现有5 份材料对以上3 种病害均表现抗性，为理想的抗原材料。然而，东野对稻曲病的抗性情况尚不清楚。【拟解决的关键问题】在之前研究中，笔者掌握了东乡野生稻稻曲病人工接种技术，在此基础之上，笔者继续开展了东野对稻曲病抗性鉴定，以了解其对稻曲病抗性水平，同时对其抗病原因进行初步分析，为东野在水稻抗稻曲病育种工作中应用给予评价。

1 材料与方法

1.1 东乡野生稻对稻曲病抗性鉴定

1.1.1 供试水稻种植与管理 东乡野生稻的种植与管理：东野单株材料于2015 年从江西省农科院水稻研究所东野异地保存圃中获得，共107 份，每份材料种植1 兜，兜与兜之间距离60 cm，接种试验于2016 年进行。东野单株在自然条件下按常规方法进行管理，防治虫害但不防治病害，其适合接种孕穗期在9 月5 日左右，并不会因为种植时间的提前或延后而改变。两优培九的种植与管理：目前尚没有野生稻对稻曲病抗性鉴定的报道，因此笔者以感病栽培水稻两优培九作为对照。两优培九共播种两组，第1组于5月15日播种（CK1），适合接种孕穗期在8月15日左右。第2组分别于6月6日、6月13日、6 月20 日播种（CK2），适合接种孕穗期在9 月5 日左右。第1 组两优培九为正常播种，用于该水稻适宜播种期下的稻曲病菌接种试验。第2 组两优培九为推迟播种，目的是让该组水稻孕穗期与东野孕穗期一致，以便于东野和对照可以在相同时间内进行接种试验。2 组水稻移栽秧龄30 d，每批移栽10 行，每行8 丛，株行距21 cm×25 cm，设保护行和工作行。两优培九在自然条件下按常规方法进行管理，防治虫害但不防治病害。

1.1.2 稻曲病菌菌株及接种体准备 供试强致病力稻曲病菌菌株UvB367 由江苏省农业科学院植物保护研究所刘永锋研究员提供。将该菌株活化后挑取新鲜稻曲病菌菌丝体到含有100 mL 马铃薯蔗糖液体培养基中，28 ℃、120 r/min条件下震荡培养7 d。之后用组织捣碎机捣碎配制成菌丝片段-分生孢子混合液接种体，用无菌水将该接种体分生孢子浓度稀释至1×106个/mL备用。

1.1.3 稻曲病菌接种 参考张君成等[13]、胡建坤等[14]报道，采用注射接种方法，选择东野及两优培九生长期分别处于剑叶与倒二叶叶枕距为（4±0.5）cm 和（6±0.5）cm 的稻穗于当日16：00—18：00进行接种，接种菌液量为2 mL，不足2 mL 的直至菌液从剑叶叶鞘处流出为止。根据水稻实际生长情况，每个东野单株材料接种稻穗5～10穗，每批次两优培九接种稻穗20穗。

1.1.4 稻曲病发病情况调查 于接种后10 d进行第1次水稻稻曲病病情调查，之后每隔3 d调查1次，以水稻接近成熟时稻曲球不再增加时结束调查。调查方法为统计每个接种稻穗上病粒数（稻曲球个数）并计算病穗平均病粒数。

参考王舒婷[15]方法，制定了稻曲病抗病性分级标准：病穗平均病粒数=0，高抗（HR）；0＜病穗平均病粒数≤2，抗病（R）；2＜病穗平均病粒数≤5，中抗（MR）；5＜病穗平均病粒数≤10，中感（MS）；10＜病穗平均病粒数≤15，感病（S）；病穗平均病粒数＞15，高感（HS）；

1.2 东乡野生稻抗稻曲病原因初步分析

1.2.1 东乡野生稻及两优培九穗苞菌液容纳量及不同菌液量接种后两优培九发病情况调查 参考1.1.3，分别随机选择20 穗东野及两优培九进行注射接种，接种至菌液从剑叶叶鞘处刚溢出为止，计算接种菌液量，即为穗苞菌液容纳量。统计最小穗苞菌液容纳量、最大穗苞菌液容纳量及平均穗苞菌液容纳量。另随机选择20 穗两优培九进行注射接种，接种菌液量分别为0.5，1，1.5，2 mL，随后参照1.4 进行稻曲病发病情况调查。

1.2.2 东乡野生稻及两优培九破口时穗苞长度及直径调查 当1.2.1 接种水稻刚破口时，分别测量其穗苞长度及直径，并计算其平均穗苞长度及平均直径。穗苞的长度为倒二叶叶枕与穗苞顶端的距离，穗苞直径为整个穗苞最粗的地方的宽度。

1.2.3 接种后10 d 气温调查 在1.1.3 参试水稻接种后，分别记录其后10 d 天气的日最高温度、日最低温度，计算其平均日最高温度、平均日最低温度以及总平均温度。

2 结果与分析

2.1 东乡野生稻对稻曲病抗性

调查结果显示，107份东野材料对稻曲病抗性存在高抗、抗病、中抗、中感4个等级，不存在感病和高感材料，说明不同东野单株材料对稻曲病抗性存在差异（表1）。4个抗性等级材料中，表现高抗的材料有19 份，占鉴定材料的17.76%；表现抗病的材料有74 份，占鉴定材料的69.16%；表现中抗的材料有12 份，占鉴定材料的11.21%；表现中感的材料有2 份，占鉴定材料的1.87%，高抗及抗病材料占鉴定材料的86.92%，没有感病及高感材料，表明东野材料整体对稻曲病有较好的抗性（表2）。对照两优培九调查结果显示，第一组对照（CK1）稻曲病平均数为28.90，抗性等级为高感，第二组对照（CK2）稻曲病平均数为6.25，抗性等级为中抗，表明在其他接种条件相同情况下，推迟播种后的两优培九其稻曲病病情指数明显低于正常播种下的稻曲病病情指数。

表1 107份东乡野生稻单株材料对稻曲病菌的抗性结果Tab.1 Resistance results of 107 Dongxiang Wild Rice materials to Ustilaginoidea virens

表2 不同抗性东乡野生稻单株材料数量及比例Tab.2 Number and proportion of materials with different resistance levels

2.2 东乡野生稻抗稻曲病原因初步分析

2.2.1 东乡野生稻穗苞菌液容纳量 调查结果显示，在接种的20穗东野材料中，最小的穗苞菌液容纳量为0.52 mL，最大的穗苞菌液容纳量为1.53 mL，平均穗苞菌液容纳量为0.88 mL；在接种的CK1材料中，最小的穗苞菌液容纳量为1.41 mL，最大的穗苞菌液容纳量为3.24 mL，平均穗苞菌液容纳量为1.93 mL；在接种的CK2 材料中，最小的穗苞菌液容纳量为1.43 mL，最大的穗苞菌液容纳量为2.68 mL，平均穗苞菌液容纳量为1.79 mL（表3）。该结果表明，在稻曲病人工接种试验中，东野材料稻曲病菌穗苞菌液容纳量远远低于两优培九；推迟播种的两优培九的最多接种菌液量与正常播种的两优培九差异不明显。

表3 东乡野生稻及两优培九穗苞菌液容纳量Tab.3 The inoculum capacity of Dongxiang Wild Rice and Liangyoupeijiu

2.2.2 不同菌液量接种后两优培九发病情况 调查结果显示，当接种菌液量为0.5 mL时，稻曲球个数平均值为3.95，抗性鉴定结果为中抗（MR）；当接种菌液量为1 mL时，稻曲球个数平均值为10.15，抗性鉴定结果为感病（S）；当接种菌液量为1.5 mL时，稻曲球个数平均值为26.40，抗性鉴定结果为高感（HS）；当接种菌液量为2 mL时，稻曲球个数平均值为31.20，抗性鉴定结果为高感（HS）（表4）。该结果表明，在其他条件相同的情况下，接种菌液量的减少会降低稻曲病发病程度。

表4 不同接种菌液量接种后稻曲球个数Tab.4 Number of flash smut balls after inoculation with different inoculum liquid

2.2.3 东乡野生稻及两优培九破口时穗苞长度及直径 调查结果显示，东野破口时穗苞长度最小值为21.57 cm，最大值为33.68 cm，平均穗苞长度为28.73 cm；CK1破口时穗苞长度最小值为18.90 cm，最大值为25.13 cm，平均穗苞长度为22.05 cm；CK2破口时穗苞长度最小值为16.53 cm，最大值为23.36 cm，平均穗苞长度为19.94 cm。东野破口时穗苞直径最小值为0.51 cm，最大值为0.75 cm，平均穗苞长度为0.65 cm；CK1破口时穗苞直径最小值为0.68 cm，最大值为1.03 cm，平均穗苞长度为0.87 cm；CK2破口时穗苞直径最小值为0.60 cm，最大值为0.91 cm，平均穗苞长度为0.79 cm（表5）。该结果表明东野材料与两优培九穗型存在显著差异，其穗苞长度显著大于两优培九，穗苞直径显著小于两优培九。

表5 东乡野生稻及两优培九破口时穗苞长度与直径Tab.5 The spike length and width of Dongxiang Wild Rice and Liangyoupeijiu when spike broke

2.2.4 接种后10 或16 d 天气温度 在该试验中CK1 接种时间为8 月15 日，其后10 d 日最高温度平均值为32.4 ℃，日最低温度平均值为24.2 ℃，日平均温度平均值为28.3 ℃。CK2 接种时间为9 月4 日，其后10 d 日最高温度平均值为28.3 ℃，日最低温度平均值为21.1 ℃，日平均温度平均值为24.7 ℃。由于东野单株材料之间孕穗时间略有差异，因此其接种时间为9 月4 日至9 月10 日，共计7 d，因此其测温时间为9 月5 日至9 月20 日，总计16 d，其日最高温度平均值为27.4 ℃，日最低温度平均值为20.6 ℃，日平均温度平均值为24.0 ℃（表6，图1）。该结果表明，东野及对照CK2 接种后气温温度显著低于CK1 接种后的温度。

图1 不同处理接种后10或16 d日平均温度对比Fig.1 Comparison of daily average temperature 10 or 16 days after inoculation with different treatments

表6 不同处理接种后10或16 d温度Tab.6 Temperature at 10 or 16 days after inoculation with different treatments

3 小结与讨论

有研究认为，稻曲病的发生程度与水稻株形或穗型存在一定的相关性。徐正进等[16]、刘伯林等[17]一致认为稻曲病的发生与水稻穗部性状有较密切的联系，相关性大小为每穗粒数、二次枝梗粒数、二次枝梗数、着粒密度和二次粒率，即有二次枝梗个数和二次枝梗粒数多的大穗、密穗型才发病率高，一次枝梗数和一次枝梗粒数多的大穗、密穗型发病率不一定高，而二次枝梗个数和二次枝梗粒数越多，水稻穗直径越大。王大为等[18]则指出，水稻稻曲病的发生不仅与上述穗部性状相关以外，还与穗长等性状呈极显著或显著的负相关，长穗型水稻品种不易发病。本研究中，东野材料穗部性状与对照两优培九存在显著差异，其穗苞直径显著小于两优培九，其穗苞长度显著大于两优培九，其对稻曲病抗性也远远高于两优培九，该结论与上述研究成果一致。进一步研究表明，东野材料穗苞菌液容纳量显著低于对照两优培九，这可能与它们穗型的显著差异有关，不同接种菌液量在两优培九上的接种试验又表明接种菌液量的多少与病情发生重轻呈现正相关性，即接种菌液越多，稻曲病发病越重。因此，穗型与稻曲病发生程度之间的相关性，可能是由于不同穗型导致水稻穗苞内部无谷粒空间的不同，间接导致了在自然条件或人工接种下水稻与病原菌之间接触的频率与数量的不同，从而影响了稻曲病发生程度。对于东野材料，其穗苞呈细长状，穗苞中无谷粒空间体积较小，间接降低和减少了东野材料谷粒在自然生长或者人工接种中与稻曲病菌接触的频率与数量，减轻了稻曲病的发生程度，这可能是东野材料对稻曲病整体抗性水平较高的原因之一。

在影响稻曲病发生的因素中，降水、湿度、温度及日照时长等气象因素是另一些被重点研究的对象。有研究认为稻曲病的发生只受某一种气象因素影响，钱均瑞等[19]研究表明随着光照强度的逐渐减弱，稻曲病的发病率有上升趋势。更多研究认为稻曲病的发生受多种气象因素综合影响，Fujita 等[20]发现低温高湿（温度15 ℃、湿度100%）有利于稻曲病的侵染，但较高温度（25～35 ℃）有利于病害显症；吕川根等[21]研究表明两优培九稻曲病发病率与抽穗后0～15 d 的平均气温呈显著正相关，相对湿度起协同作用；潘勋等[22]对1987—1996 年十年间的气象资料统计分析发现稻曲病严重度与7 月中旬至8 月底累计日照时数和总降雨关系密切，日照时数减少和降雨量增加时病情趋于严重；Bhagat 等[23]报道在日夜较低温度（约25～30 ℃）、有大的降雨量以及较高的相对湿度时稻曲病发病率高，每日的云阴时数与病害的程度呈正相关。但不同气象因素之间存在着必然的相关性，比如降水的增多必然会导致空气湿度的增加及日照时间的减少，也经常会伴随着气温的下降，因此推断上述气象因素并非都对稻曲病的发生起重要影响。目前更多研究表明稻曲病的初传染源为厚垣孢子[24]，厚垣孢子只有在水中才能萌发[25]，表明湿度对稻曲病菌的侵染很重要。厚垣孢子萌发温度为21～31 ℃，以28 ℃适宜，萌发后形成的菌丝体在22～30 ℃下均能良好生长，以28 ℃生长最快，低于13 ℃时，菌丝仍能生长但速度明显减慢，高于35 ℃时，菌丝生长被抑制[26]，表明温度对稻曲病的发生程度影响较大。综上所述，湿度及温度才是影响稻曲病发生及发病程度最重要的气象因素。本研究中，正常播种两优培九（CK1）接种后10 d的日平均温度平均值为28.3 ℃，利于稻曲病菌的生长，而推迟播种两优培九（CK2）接种后10 d 及东野材料接种后16 d 日平均温度平均值分别为24.7 ℃和24.0 ℃，显著低于稻曲病菌生长的最适宜温度，从而减轻了稻曲病的发病程度，这可能间接影响了东野材料对稻曲病的抗性，而且笔者推测，由于东野材料与常规栽培稻相比生育期晚20～30 d，导致其孕穗后期温度偏低是其对多种病虫害都具有不同程度抗性的原因之一。

目前尚没有东野材料对稻曲病抗性鉴定的报道，本研究填补了这一空白。利用人工接种技术，鉴定了107 份东野材料对稻曲病的抗性，结果表明，东野对稻曲病有较高的抗性水平，其中86.92%的材料对稻曲病具有抗病及以上的抗性等级。通过对东野材料穗苞长度、宽度、菌液容纳量以及接种后一定时间内气温调查、统计及分析，表明东野材料对稻曲病的抗性可能与东野材料细长状的穗型不利于稻曲病菌的侵入，以及东野材料孕穗时气温较低、不利于稻曲病菌厚垣孢子的萌发及菌丝体的生长有关。东野材料的穗型及生育期都属于可遗传因素，因此可以在水稻育种工作中应用，通过改良栽培水稻的穗型及推迟水稻生育期，提高水稻对稻曲病的抗性。东野材料对稻曲病的抗性应该还存在其他的抗病机制，需要进行进一步研究。