基于网络药理学分析蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的作用机制

江国华，谭燕平，陈宣睿，陈嘉南，徐鸿棋，朱 晟，伍远平，陈跃洲

（1.广州中医药大学深圳临床医学院，广东 深圳 518172；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510006）

糖尿病足溃疡是指糖尿病患者因肢端神经血管异常而继发的足部感染或溃疡。糖尿病足溃疡是导致糖尿病患者截肢、死亡的重要因素[1]。糖尿病足溃疡在中医学中属于“脱疽”、“消渴”等范畴，中医认为湿热与毒瘀是此病的主要致病因素[2]。近年来，中医在糖尿病足溃疡的治疗中逐渐得到应用，并取得了较好的效果[3]。中药蚓黄散由黄柏、地龙、血竭三味中药组成，具有清热、解毒、利湿的功效，能促进糖尿病足溃疡患者创面的愈合，降低其截肢的发生率[4]。相关的研究表明，清热解毒类中药可改善血清晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products AGEs）、肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子的水平，延缓糖尿病足溃疡的进展[5]。蚓黄散作为清热解毒类中药制剂，对糖尿病足溃疡的治疗效果已得到临床证实，但其确切的作用机制尚不清楚[6]。网络药理学是基于系统生物学理论，对生物系统进行网络分析，选取特定的信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。该学科可从整体出发，针对中药制剂的配伍、作用规律等进行不同层次的网络筛选，构建多成分、多靶点、多途径的分子机制，现已成为中药复方研究的新方法[7-9]。本研究基于网络药理学方法，构建“成分-靶点-信号通路”多维网络，探究应用蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的作用机制，为蚓黄散的临床应用提供一定的理论依据。

1 资料和方法

1.1 蚓黄散药物活性成分的筛选

通过中药系统药理分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）并结合其他数据库的文献，获得蚓黄散的全部化学成分，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类 药 性（Drug-Likeness，DL）≥0.18为筛选条件[10-11]，确定候选化合物，并利用Uniprot数据库（https://www. uniprot.org）规范其靶点名称。

1.2 糖尿病足溃疡疾病靶点的筛选

通 过GeneCards数 据 库（https://www.genecards.org）和OMIM数据库（https://www.omim.org/）以“Diabetic foot ulcer”为关键词检索出与糖尿病足溃疡相关的基因。

1.3 构建蚓黄散成分-靶点网络

利用Cytoscape 3.7.2软件构建蚓黄散成分-靶点网络图，并分析成分与靶蛋白之间的相关性。

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用（proteinproteininteraction，PPI）网络图

将上述预测的可能靶标输入STRING 10.5数据库（https://string-db.org），获取蛋白质相互作用信息，并得出PPI网络图。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

应用David数据库（https://david.ncifcrf.gov）分别进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

1.6 构建成分-靶点-信号通路网络图

利用Cytoscape 3.7.2软件合并蚓黄散与靶点蛋白的相关信息、信号通路与靶点蛋白的相关信息，构建成分-靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选结果

利用TCMSP平台检索出蚓黄散中的黄柏含有140种活性成分，通过其他数据库检索出蚓黄散中的血竭含有10种活性成分，地龙含有3种活性成分。以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件进行筛选，最终筛选出50个候选化合物。

2.2 成分-靶点网络图

在Cytoscape 3.7.2软件中利用蚓黄散筛选出的成分与靶点信息，构建蚓黄散成分-靶点网络图（详见图1）。图1中有136个节点和1018条边，包括30个化合物节点（绿色）、106个靶节点（蓝色）。化合物的度值越高，则其在网络中节点对应的边越多，在网络中起越关键的作用。在蚓黄散的成分-靶点网络中，度值靠前的化合物分别为槲皮素（quercetin）、异紫堇杷明（Isocorypalmine）、氢化小檗碱〔(S)-Canadine〕、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol），其对应的靶点数分别为70、37、35、33、33。由此可见，槲皮素、异紫堇杷明、氢化小檗碱、β-谷甾醇、豆甾醇可能是蚓黄散发挥药效的主要成分。度值靠前的靶点分别为AR、ESR1、PPARG、NOS2，这些靶点可能是蚓黄散发挥药效的主要靶点。

图1 蚓黄散的成分-靶点网络

2.3 蚓黄散与糖尿病足溃疡的交集靶点

利用TCMSP共查询出蚓黄散预测效靶106个，同时从Genecards数据库和OMIM数据库收集糖尿病足溃疡的相关靶点2398个，将二者取交集后得到应用蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的可能靶标76个。详见图2。

图2 蚓黄散与糖尿病足溃疡交集基因的维恩图

2.4 蚓黄散与糖尿病足溃疡交集的PPI网络

在STRING 10.5数据库中对上述76个交集蛋白进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，得到图3。图3中有76个节点、1310条边，平均度值为17.24。其中各节点表示作用靶点，靶点之间的彼此关系用边表示，边数越多表明该节点对应的作用靶点越重要。由度值得出主要作用靶点的信息条形图（详见图4）。由图4可知，白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、JUN基因、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、IL-1β排序靠前，在PPI网络中起着重要的联系作用，可能是关键的作用靶点。

图3 蚓黄散与糖尿病足溃疡交集的PPI图

图4 互作关系排名靠前的相关靶标

2.5 基因功能和通路分析结果

应用David数据库分别进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析（详见图5、图6）。在KEGG通路富集分析中排名靠前且与糖尿病足溃疡联系密切的通路包括PI3KAkt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症相关通路（Pathways in cancer）、TNF信 号 通 路（TNF signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）等。

图5 蚓黄散靶标的GO功能富集分析

图6 用蚓黄散治疗糖尿病足溃疡相关靶蛋白的KEGG通路富集分析

2.6 成分-靶点-信号通路

蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的药物活性成分-靶点-信号通路详见图7。图7中含30个化合物节点（绿色）、76个靶节点（蓝色）及20个通路（紫色），筛选出的蚓黄散药物活性成分可通过作用于多个靶点而调控多条信号通路，从而协同发挥治疗糖尿病足溃疡的作用。

图7 蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的药物活性成分-靶点-信号通路图

3 讨论

糖尿病足溃疡创面愈合的过程由多种细胞因子、炎性因子共同参与。研究发现，炎症反应的发生发展与糖尿病足溃疡创面的愈合程度密切相关[12]。李友山等[13]研究指出，炎症反应始终贯穿糖尿病足溃疡的病理过程，这与祖国医学中“湿热与毒瘀”的致病特点极为相似，而蚓黄散具有明显的抗炎作用，可用于治疗糖尿病足溃疡。进一步发掘并分析蚓黄散潜在的药理机制，对应用此药治疗糖尿病足溃疡具有重要的意义。本研究通过进行网络药理学研究表明，蚓黄散中的药物活性成分主要为槲皮素、异紫堇杷明、氢化小檗碱、β-谷甾醇、豆甾醇等。有报道称，槲皮素可通过下调TNF-α、IL-1等炎性因子的表达及下调PI3K-Akt信号通路而抑制炎症反应[14]。本研究通过分析交集蛋白的PPI网络发现，蚓黄散中的有效成分可能是通过作用于IL-6、VEGFA、JUN基因、PTGS2、EGF、IL-1β等靶点而起作用。IL-6、IL-1β、PTGS2主要参与机体的各种炎症反应[15-16]。VEGFA在血管形成中起到重要的作用，糖尿病足溃疡患者因血管内皮功能遭到破坏，故可导致其血清VEGFA的水平下降[17]。本研究通过进行KEGG通路富集分析发现，蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的作用机制主要涉及PI3K-Akt信号通路、癌症相关通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路等。本研究发现，IL-6、PTGS2、VEGFA主要在PI3K-Akt信号通路上富集，而PI3K-Akt信号通路在内皮细胞增殖的过程中发挥着关键作用。有研究指出，蚓黄散中的黄柏在抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的过程中也可使环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）失活，其抗炎作用与下调PI3K-Akt信号通路极为相似[18-19]。这表明，应用蚓黄散治疗糖尿病足溃疡是通过多生物途径、多信号通路共同起作用的。

综上所述，蚓黄散可通过多成分、多靶点、多信号通路协同治疗糖尿病足溃疡。但本研究仅通过生物信息学手段对蚓黄散治疗糖尿病足溃疡的机制进行初步分析，存在一定的局限性，日后需对蚓黄散可能存在的治疗靶点、作用通路等加以验证。