氰氟草酯对斑马鱼的急性毒性和生物富集效应

涂杰 沈艳 刘晓敏 武健 董旭 朱伟华 张勇

摘要 [目的]评价97%氰氟草酯原药对斑马鱼的急性毒性和生物富集效应。[方法]参考《化学农药环境安全评价试验准则》，测定97%氰氟草酯原药对斑马鱼的急性毒性和生物富集效应，计算半效应浓度LC 50和生物富集系数BCF。[结果]97%氰氟草酯原药对斑马鱼急性毒性为中毒，生物富集等级属于中等富集性。[结论]在实际应用过程中，氰氟草酯应严格控制其用量，尽可能减少对斑马鱼和水生生态系统的危害。

关键词 氰氟草酯;斑马鱼;急性毒性;生物富集

中图分类号 X 503.225  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）18-0084-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Acute Toxicity and Bioconcentration of Cyhalofop-butyl in Brachydanio rerio

TU Jie1，2， SHEN Yan2， LIU Xiao-min2 et al

（1.Hefei University， Hefei，Anhui  230031;2.Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui  230031）

Abstract [Objective] To evaluate the acute toxicity and bioenrichment effects of 97% cyhalofop-butyl on Brachydanio rerio. [Method] The acute toxicity and bioaccumulation effect of 97% cyhalofop-butyl on  Brachydanio rerio were determined. The median effective concentration LC 50 and bioconcentration factor BCF were calculated by reference to Test Guidelines on Environmental Safety Assessment for Chemical Pesticides. [Result] The acute toxicity of 97% cyhalofop-butyl on Brachydanio rerio was middle toxic;cyhalofop-butyl was a kind of medium bioconcentration pesticide. [Conclusion] The cyhalofop-butyl should be strictly controlled to minimize the damage to zebrafish and aquatic ecosystem.

Key words Cyhalofop-butyl;Brachydanio rerio;Acute toxicity;Bioaccumulation

作者簡介 涂杰（1993—），男，安徽安庆人，硕士研究生，研究方向：农药环境毒理。

*通信作者，副研究员，从事除草剂、杀菌剂药效及安全性评价研究。

收稿日期 2020-12-21;修回日期 2021-02-19

我国是世界范围内最大的农药生产国和使用国之一，每年施用大量的化学农药用于防治农作物病虫草害[1]。2015年农业部公布我国农药利用率仅为36.6%[2]。其余大部分未被利用的化学农药则进入自然环境中，不仅对水体、土壤等生态系统造成污染，也会导致非靶生物受到不同程度的毒害作用。

水生生物是在农药污染的水环境中的非靶标生物[1]。鱼类作为水生生物中的重要物种，所受到的农药污染危害最大，水质污染会对渔业造成巨大损失[3]。蓝色斑马鱼是一种小型杂食性淡水热带鱼，成鱼体长3～4 cm，染色体数为50条[4]。斑马鱼饲养方法简单，对水质要求不高，水温25～31 ℃为宜，pH 7～8为最适宜[5]。因此，ISO和OECD已将斑马鱼作为毒理学测试标准的推荐测试物种，用于测试化合物对生物体的毒性。目前研究最多的是斑马鱼的急性毒性试验。

氰氟草酯是水稻田应用最广泛的除草剂之一，目前因用量大而使杂草对其产生抗性，其对水生物及水体环境的影响同样值得关注。笔者选用97%氰氟草酯原药，研究其对斑马鱼的急性毒性和生物富集效应，旨在为更全面评价氰氟草酯在环境中的安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验生物

蓝色斑马鱼（Brachydanio rerio），购自合肥市裕丰花鸟虫鱼市场。试验用水，曝气自来水（24 h以上），水温为21～25 ℃，pH为6.0～8.5，溶解氧含量不低于空气饱和值的60%，水质硬度为10～250 mg/L（以CaCO 3计）。试验前预养7 d（与试验相同的环境条件下），且试验前24 h内不喂食。

1.2 试验药剂

97%氰氟草酯原药由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提供。氰氟草酸标准品购自上海皓元生物医药科技有限公司。99.8%重铬酸钾、助溶剂丙酮（分析纯）、乳化剂吐温-80等均购自国药集团化学试剂有限公司。乙腈、甲醇、乙酸铵、甲酸均为色谱纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要仪器

万分之一电子天平、温度计、水质硬度计、溶解氧分析仪、移液器、便携式pH计、日本岛津SHIMADZULCMS-8030液相色谱-串联质谱仪、高速离心机、涡旋振荡器等。

1.4 试验方法

1.4.1 斑马鱼急性毒性试验。

采用半静态法研究97%氰氟草酯原药对斑马鱼的急性毒性效应[6]。设置2.000、2.500、3.125、3.906、4.883、6.104、7.629 mg/L 7个浓度组，同时设空白和助溶剂对照组，每隔24 h更换试验溶液。试验时，先向试验鱼缸内加入经活性炭吸附后的曝气自来水配制的各试验溶液，然后将预养的斑马鱼放入试验鱼缸内，每缸7条，不设重复。试验开始时及每隔24 h观察鱼死亡和中毒状况，并测定各处理浓度和空白对照鱼缸内水的pH、溶氧量及温度等。

1.4.2 斑马鱼生物富集试验。

采用半静态法研究97%氰氟草酯原药对斑马鱼的生物富集效应[7]。根据急性毒性试验的96 h-LC 50，设置3.9×10-2 mg/L（1/100）和0.39 mg/L（1/10）2个浓度组，同时设空白和助溶剂对照组。每组设4个重复，每重复40條鱼。每隔24 h更换试验药液，并于0、24、48、96、144、192 h从各处理组中取50 mL试验药液和5条鱼样，用于检测其中的供试药物及其代谢产物的含量，同时测定pH、水温、溶解氧含量等并观察鱼中毒和死亡情况。

1.4.3 样品前处理。

水样：取2.000 mL离心后的水样至10 mL塑料离心管，加入2.000 mL色谱纯乙腈，涡旋混匀1 min，静置10 min，过0.22 μm有机滤膜，待测。

鱼样：称取已匀浆试样2 g于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈溶液，振荡提取40 min，加入1～2 g氯化钠，振摇2 min，以5 000 r/min离心3 min，取上层溶液2 mL过0.22 μm有机系微孔膜，待测。

1.4.4

仪器分析方法。SHIMADZULCMS-8030液相色谱-串联质谱仪检测条件：色谱柱Shim-pack XR-ODS-Ⅲ，2.0 mm×50 mm，1.6 μm;流动相A-5 mmol/L乙酸铵水溶液+0.02%甲酸;B-甲醇;流速0.4 mL/min;进样体积2 μL;柱温40 ℃。

1.4.5

标准曲线的绘制。用甲醇配制1.000、0.800、0.500、0.100、0.080、0.050、0.010、0.005 mg/L氰氟草酯标准品系列标准工作溶液按上述条件进样分析，以浓度-峰面积绘制氰氟草酯标准曲线，其回归方程为y=17 993x+61.584，r2=0.994 1。用甲醇配制1.000、0.800、0.400、0.100、0.080、0.040、0.010、0.008 mg/L氰氟草酸标准品系列标准工作溶液按上述条件进样分析，以浓度-峰面积绘制氰氟草酸标准曲线，其回归方程为y=89 109x-459.7，r2=0.999 6。结果表明，氰氟草酯和氰氟草酸分别在0.005～1.000 mg/L和0.008～1.000 mg/L浓度范围内线性良好。

1.4.6

氰氟草酯和氰氟草酸在水样中添加回收率测定。分别向试验用水中添加氰氟草酯和氰氟草酸的标准溶液，浓度均配制为0.2、0.5、1.0 mg/L，采用上述前处理方法和仪器分析方法，测定试验溶液浓度，每个浓度设3个重复。氰氟草酯平均回收率为81.6%～85.3%，相对标准偏差（RSD）为1.8%～2.8%;氰氟草酸平均回收率为79.0%～82.4%，RSD为2.3%～3.7%。

1.4.7

氰氟草酯和氰氟草酸在鱼样中添加回收率测定。在鱼样中分别添加氰氟草酯和氰氟草酸标准溶液，均配制为0.01和0.50 mg/L 2个添加浓度，每个浓度设3个重复。氰氟草酯平均回收率为85.8%～86.0%，RSD为3.5%～3.8%;氰氟草酸平均回收率为78.7%～81.7%，RSD为2.7%～3.9%。

1.5 数据方法

统计分析：用统计软件SPSS 20.0计算斑马鱼急性毒性试验LC 50及95%置信区间。

氰氟草酯残留总量计算方法：氰氟草酯总量=氰氟草酯含量+氰氟草酸含量×R，其中系数R=1.186为母体分子量与代谢物分子量比值。

生物富集系数（BCF）计算公式为BCF = Cfs /Cws，其中，Cfs为平衡时鱼体内的供试物含量，Cws为平衡时水体中的供试物含量。依据《准则》判定氰氟草酯对斑马鱼的毒性等级与生物富集等级（表1、2）。

2 结果与分析

2.1 参比试验结果

为了解选用斑马鱼的生长状况及敏感性情况，试验之前用重铬酸钾进行斑马鱼参比试验。重铬酸钾对斑马鱼的参比试验结果显示，其半效应浓度24 h-LC 50为245.515 mg/L，95%置信限为212.990～284.946 mg/L。

2.2 氰氟草酯对斑马鱼的急性毒性

试验过程中空白对照组以及助溶剂对照组的斑马鱼死亡情况与试验开始时比较无明显变化。根据97%氰氟草酯原药对斑马鱼的急性毒性试验结果，按照理论浓度计算，采用统计软件SPSS 20.0分析其半致死浓度96 h-LC 50和95%置信限。97%氰氟草酯原药对斑马鱼急性毒性的96 h-LC 50为3.964 mg/L，95%置信限为3.327～4.737 mg/L（表3）。试验结果的毒性等级参照《化学农药环境安全评价试验准则》进行划分，97%氰氟草酯原药对斑马鱼毒性等级为“中毒”。

2.3 氰氟草酯对斑马鱼的生物富集效应

根据97%氰氟草酯原药对斑马鱼的生物富集性试验结果，按照生物富集系数计算公式，97%氰氟草酯原药96 h-LC 50的1/100试验处理组中，6 d时水体及鱼体中氰氟草酯含量达到平衡，斑马鱼对氰氟草酯的生物富集系数（BCF 6d）为16.3（表4）。97%氰氟草酯原药96 h-LC 50的1/10试验处理组中，6 d时水体及鱼体中氰氟草酯含量达到平衡，斑马鱼对氰氟草酯的生物富集系数（BCF 6d）为28.6（表5）。依据《化学农药环境安全评价试验准则》中的标准，判断氰氟草酯对斑马鱼的富集效应等级为中等富集性。

3 结论与讨论

鱼类不仅是生态系统中的重要生物，也是人类的主要食物之一，农药的合理施用对鱼类的生存乃至人类的健康至关重要。因此，农药对鱼类的毒性评价工作一直是农药环境评价的重点[8]。斑马鱼急性毒性试验是检测环境污染物急性毒性的常用方法之一[1]。而鱼类生物富集试验对农药的环境风险评估及其慢性毒性研究具有非常重要的意义[9]。吴迟等[10]和李如美等[11]分别研究了戊唑醇和叶菌唑对斑马鱼的急性毒性及生物富集效应，均表明农药对斑马鱼有一定的毒害效应。

该研究选用97%氰氟草酯原药，研究了其对斑马鱼的急性毒性和生物富集效应。结果表明，97%氰氟草酯原药对鱼类急性毒性表现为中等毒性，生物富集性为中等富集性。

近年来，除草剂在农业生产中的使用量逐年增大，不同种类除草剂对水生生物的研究也越来越受到重视。廖艺钰等[12]研究了草甘膦农药对斑马鱼的毒性，急性毒性试验结果表明草甘膦属于高毒农药;研究表明，西草净对斑马鱼的急性毒性为中毒[13]，五氟磺草胺对3月龄幼鱼也表现为中等毒性[14];Al-Sawafi等[15]将斑马鱼分别暴露在0.957、1.913 mg/L 的莠去津药液中，结果表明斑马鱼能迅速富集该除草剂;何健等[16]报道了二甲四氯和二甲四氯异辛酯在斑马鱼体内均有富集效应。这表明除草剂对斑马鱼有一定的毒性并能在鱼体内不同程度的富集。

该研究是在实验室条件下进行的，氰氟草酯作为水稻田除草剂在水田施用，不可避免会进入水体，自然环境下农药的毒性效应更为复杂。若要更全面地评估该除草剂在鱼体内的累积毒性及对环境的风险，仍需进一步开展鱼类生命周期或水生生态模拟系统等方面的研究。因此氰氟草酯在田间使用时，仍应注意选择毒性较低的剂型，严格控制用药量等，科学合理的使用，尽量减少其对水体环境以及水生物的影响。

参考文献

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[5] 李洁斐，李卫华，金泰廙，等.斑马鱼及其在环境毒理学中的应用[J].环境与职业医学，2005，22（5）：460-463.

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[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学农药环境安全评价试验准则 第7部分：生物富集试验：GB/T 31270.7—2014[S].北京：中国标准出版社，2015.

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[16] 何健，周艳，孔德洋，等.2甲4氯和2甲4氯异辛酯在斑马鱼体内生物富集性[J].农药，2015，54（11）：822-824.